Meyve Ve Sebzede Peroksidaz Enzim Aktivitesinin Belirlenmesi

Biyokimya Laboratuvarı deneylerinde bazı genel bilgiler sitemizde paylaşılmaktadır. Biyokimya.Gen.Tr sitesi olarak Biyokimya hakkında herşeyi web sitemizde bulabilirsiniz.
Genel Bilgiler

Peroksidaz meyve ve sebzelerde yaygın olarak bulunan bir enzimdir. Hücreyi hidrojen peroksitin 
sebep olduğu oksidatif stresten korur. Bitki gelişmesinde önemli rollere sahiptir. Meyve ve sebzelerin 
işlenmesi sırasında rengin bozulması, lezzetin değişmesi, beslenme değerinin azalması gibi 
olumsuzluklara neden olmaktadır. Peroksidazlar bir Hidrojen donörü varlığında peroksitleri 
parçalarlar. Temel substratı H2O2’dir. Metil veya etil hidrojen peroksitler de substrat olarak 
kullanılabilir. Askorbat, fenoller ve aminler H donörü olarak görev yapmaktadırlar. 
Meyve ve sebze işleme teknolojisinde haşlama genellikle bir ön işlem olarak yapılmaktadır. Haşlama 
işleminin en önemli amacı ise meyve ve sebzelerdeki enzimleri inaktive etmektir. Peroksidaz enzimi 
bitkilerde bulunan en dayanıklı enzimdir ve peroksidaz enzimi inaktive olduğunda bütün enzimler 
inaktive olmuş demektir. Bu sebeple haşlama işleminin yeterli olup olmadığının tespiti amacıyla 
peroksidaz aktivitesi tayini yapılır.

Devamı...

Aminoasitlerin ince tabaka ve kağıt kromatografisi deneyi

Aminoasitlerin kromatografi deneyi

Kromatografi, bir karışımın bileşenlerini, bunlara seçimsel ilgi gösteren iki ya da daha çok evreden sistemler arasında farklı göçlerine bakarak tanımak, gerektiğinde niceliklerini belirlemek amacıyla yapılan ve ayırma işlemine dayanan analitik yöntemdir.

Kromatografi terimi başlangıçta, örneğin bitkisel pigmentlerde olduğu gibi cisimleri renklerine göre ayırma oluşmuş işleminden kaynaklandı, ama zamanla uygulama alanı oldukça genişledi.Kromatografi günümüzde son derece duyarlı ve etkin bir ayırma yöntemi olarak kabul edilmektedir. Duruma göre iki temel mekanizma uygulanır;

• Bileşikler ya iki sıvı evre arasında paylaşılır(bu durumda dağılım ya da paylaşım kromatografisinden söz edilir)
• Hareket halindeki bileşikler durağan katı bir evre yüzeyine bağlanır(bağlar yüzeysel ve fiziksel bir nitelik taşıdığında yüzde tutma kromatografisinden[tersinir bağ, bileşiğin bütünlüğünün korunması], buna karşılık hareketli ve yüzde tutulan bileşikler arasında gerçek kimyasal bağlar oluştuğunda iyon değişimi kromatografisinden söz edilir).

Kimyasal ve fiziksel özellikleri birbirine çok yakın olan bileşiklerden oluşan karışımları damıtma ve ayrımsal kristallendirme ile birbirinden ayırmak zor olabilir. Bu tür maddeler için çeşitli kromatografi yöntemleri kullanılarak başarılı ayrımlar yapılabilir.

Kromatografi, bir karışımın gözenekli bir ortamda, hareketli bir çözücü etkisiyle, karışım bileşenlerinin farklı harkeketleri sonucu birbirinden ayrılması olgusuna dayanır. Hareket eden faza hareketli faz, bahsedilen gözenekli ortama ise adsorban veya sabit faz denir.

Kromatografi olayında adsorpsiyon, dağılma ve değiştirme kuvvetleri rol oynar. Bu kuvvetlere göre de farklı kromatografik yöntemler farklı gruplarda toplanırlar.

Kromatografi Türleri

1. Adsorpsiyon Kromatografisi(Moleküllerin katı bir yüzeye yapışması, tek molekül tabakasından oluşan bir yüzey tabakasının oluşması)
   1. Sıvı - Katı : Kolon ve İnce Tabaka Kromatografisi
   2. Gaz - Katı : Gaz Kromatografisi
2. Dağılma Kromatografisi
   1. Sıvı - Sıvı : Kolon ve Kağıt Kromatografisi
   2. Gaz - Sıvı : Kolon ve Gaz Kromatografisi
3. İyon Değiştirme Kromatografisi
4. Jel Filtrasyon (Moleküler eleme) Kromatografisi
5. İyon çifti Kromatografisi
6. Afinite Kromatografısı
   
   
   
   aminoasit deneyleri aminoasitlerin kromatografi deneyi kromatografi nedir cumhuriyet üniversitesi biyokimya laboratuvarı sivas 

Devamı...

Protein Saflaştırmada Çöktürme Yöntemleri

1- pH Değişimi ile Çöktürme

Çözeltinin pH değerini proteinin izoelektrik noktasına (pI) yakın ya da eşit duruma getirmektir. Bu işleme izoelektrik çöktürme denir. İzoelektrik noktada protein yüzeyindeki negatif ve pozitif yükler birbirlerine eşit olacaklardır ve benzer moleküller arasında artık elektrostatik itmeler oluşmayacaktır. Bu moleküller arasında belki elektrostatik çekimler oluşacak ve bu da proteinlerin çökmesi ile sonuçlanacaktır.

İzoelektrik çöktürme genellikle istenen proteinden çok istenmeyen proteinleri çöktürmek için kullanılır, çünkü çöktürme sırasında denatürasyon ve aktivite kaybı meydana gelebilir. Bunun nedeni ise elektrostatik çekimler nedeni ile proteinin üç boyutlu yapısının bozulmasıdır.

2- İyonik Şiddeti Düşürerek Çöktürme

Bazı proteinler çözeltinin iyonik şiddetinin belirli bir değerin altına düşürülmesi ile çöktürülebilir. Bu nadiren uygulanan bir yöntem, ham ekstratların kullanılma durumlarında gerçekleştirilebilir. İyonik kuvvet sadece su ilavesi ile düşürülebilir. Böylece konsantrasyon azalırken genelde çözünürlük artmış olur. Düşük iyonik şiddet ile çöktürme işleminin gerçekleşmesi izoelektrik noktada ya da izoelektronik nokta civarında daha olasıdır.

3- İyonik Şiddeti Artırarak Çöktürme (Salting-out)

Nötral tuzların ortama giderek artan miktarda eklenmesi ile çöktürme, kullanılan en yaygın yöntemdir. Çöken protein genellikle denatüre olamamaktadır ve aktivitesi de pelletin yeniden çözülmesi ile birlikte ortaya çıkmaktadır. Ek olarak bu tuzlar proteinleri denatürasyona, proteolizize, ya da bakteriyel kontaminasyona karşı stabilize edebilirler. Bu nedenle “salting-out” aşaması, ekstratın bir gece boyunca saklanması için en uygun aşamadır. Burada çökmenin sebebi izoelektrik çökmenin sebebinden farklıdır ve bu nedenle bu iki yöntem aşamalı saflaştırmalar için sıra ile uygulanır. Salting-out protein yüzeyinin hidrofobik yapısına bağlıdır. Suyu sevmeyen gruplar genellikle proteinin iç kısmında bulunurlar ancak bazıları parçalar halinde protein yüzeyinde yer alırlar. Su molekülleri bu gruplar ile temasa zorlanır ve bunu gerçekleştirirken düzenli hale gelir. Sisteme tuzlar eklendiğinde su, tuz iyonlarını çözer ve tuz derişimi arttıkça su proteininin çevresinden ayrılarak hidrofobik parçaları açıkta bırakır. Bir protein üzerindeki bu hidrofobik parçalar diğer bir protein üzerindeki hidrofobik parçalar ile etkileşebilir ki bu da yığışım olayıyla sonuçlanır. Bu nedenle daha büyük ya da daha fazla hidrofobik bölgeler bulunduran proteinlere göre daha önce agrege olacak ve çökeceklerdir. Oluşan agregatlar genellikle birkaç proteinin karışımıdır. İzoelektrik çöktürmede olduğu gibi ekstratın yapısı ilgilenilen proteinin çökmesi için gerekli olan tuz konsantrasyonunu etkileyecektir. İzoelektrik çöktürmede olanın aksine, sıcaklığın yükseltilmesi, çökmenin miktarını arttırmaktadır. Ancak ” salting-out” genellikle aktivite kaybını azaltmak için 4 ° C ‘de gerçekleşir. Tuz olarak genellikle amonyum sülfat kullanılır.

Tuzun etkinliği genel olarak anyonun türüne bağlı olarak belirlenmektedir. Yükü fazla olan anyonlar en etkili olanlardır. Eski sıralanışı fosfat>sülfat>asetat>klorür şeklindedir. Fosfat sülfattan daha etkili olduğu halde pratikte nötral pH’ta fosfat genel olarak en etkili hali olan PO4-3 den daha çok HPO4-2 ve H2PO4- iyonları olarak bulunduğundan amonyum sülfat daha çok tercih edilmektedir. Tek değerlikli katyonlar en etkili katyonlardır. Etki sıralanışı NH4+>K+>Na+ şeklindedir. Tuzun az miktarda safsızlık içermesi kullanımda önemli hata oluşturmaz, ve miktarda fazla kullanıldığında fiyatı ucuz olmalıdır. Birkaç molarlık konsantrasyonlar gerektiğinden tuzun çözünürlüğü de önemlidir. Bu nedenle birçok potasyum tuzu uygun görülmemektedir. Olası denatürasyon riski ya da çözünürlükte değişmeler sebebiyle, tuzun çözünmesi esnasında sıcaklık yükselmesi az olmalıdır. Son olarak, oluşan son çözeltinin yoğunluğu önem taşımaktadır. Çünkü agregat ve çözelti arasındaki yoğunluk farkı santrifüj ile ayırmada önemlidir.

4- Organik Çözücüler ile Çöktürme

Pek çok protein, aseton veya etanol gibi su ile karışabilen organik çözücülerin eklenmesi yoluyla çöktürülebilir. Burada proteinin çökme davranışı geliştiren faktörler izoelektrik çöktürmedekilere benzerdir ve salting-out etkisi ile çöktürmede olduğundan farklıdır. Bu nedenle,bu yöntem bir saflaştırma prosesinde izoelektrik çöktürmeye alternatif olarak ya da salting-out ile birleştirilerek kullanılabilir. Organik çözücünün ilavesi çözeltinin dialektrik sabitini ve dolayısıyla çözme kuvvetini düşürmektedir. Böylece proteinin çözünürlüğü azaltılmış olur ve elektrostatik çekimler etkisi ile agregasyon meydana gelebilir. Çökme pH değeri proteinin pI değerine yakın olunca daha kolay bir şekilde meydana gelmektedir. Proteinin boyutu da çökme davranışını geliştirmektedir.Buna göre daha büyük proteinler diğer özellikleri aynı olan daha küçük proteinlere göre daha düşük organik çözücü konsantrasyonlarında çökeceklerdir. Bununla birlikte bazı hidrofobik proteinler, özellikle hücre membranlarında bulunanlar organik çözücüler etkisi ile çöktürülemezler, ve aslında membranlardan organik çözücü proteinin hidrofobik parçaları etrafındaki su moleküllerinin yerini alacaktır, ki bu da çözünürlüğün artması ile sonuçlanacaktır.

Denatürasyonu minimuma indirmek için organik çözücülerle çöktürme işlemi 0°C’de veya altındaki sıcaklıklarda gerçekleştirilmelidir. Daha yüksek sıcaklıklarda protein konformasyonu hızlı bir şekilde değişecektir. Bu da organik çözücü moleküllerinin proteinin iç kısmına erişmesine olanak sağlayacaktır. Burada bu moleküller hidrofobik etkileşimleri bozabilir ve denatürasyona sebep olabilirler. Organik çözücülerin sulu çözeltilerle karışımlarının donma noktasının 0°C’nin altında olması bu çöktürme işleminin uygulanabilirliği açısından şanstır.

Aseton ve etanol en çok kullanılan çözücülerdir; kullanılan diğer çözücüler metanol, propan-1-ol ve propan-2-ol’dür. Özellikle büyük ölçeklerde çalışırken güvenlik dikkate alınmalıdır; buna göre çözücü göreceli olarak toksik olmamalı ve görece olarak yüksek parlama noktasına sahip olmalıdır.

5- Organik Polimerler ile Çöktürme

PEG(polietilen glikol) en çok kullanılan organik polimerdir. Çöktürme mekanizması organik çözücülerle çöktürme mekanizması ile benzerdir. Bununla birlikte daha düşük konsantrasyonlar gerektirmektedir, genellikle %20’den daha düşük. Daha yüksek konsantrasyonlar viskoz çözelti oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Bu da çökeltinin geri kazanılmasını zorlaştırmaktadır. Polimerin molekül ağırlığı 4000’den daha büyük olmalıdır.

6- Denatürasyon ile Çöktürme

Denatürasyon ile çöktürme eğer ilgilenilen protein muamele sonrasında denatüre olmuyorsa, buna karşılık kontamine edici proteinler denatüre oluyorsa, bir saflaştırma adımı olarak kullanılabilir. Denatürasyon, sıcaklığın, pH’ın değiştirilmesi ya da organik çözücülerin eklenmesi ile gerçekleştirilebilir. Proteinlerin tersiyer yapısı denatürasyon esnasında bozulur. Bunun sonucunda rastgele sarmal yapılar oluşur. Çözelti içerisinde bu sarmallar birbirlerine dolaşırlar ve böylece agregatlar oluştururlar. Agregat oluşumu pH ve iyonik şiddet ile geliştirilebilir. Daha çok düşük iyonik şiddette ve proteinin izoelektrik noktası civarlarında gerçekleşir.

Yüksek sıcaklık ile denatürasyon: Yüksek sıcaklıklar, proteindeki konformasyonu sağlayan bağları kırarak ve birleşmiş çözücü moleküllerinin serbest kalmasını sağlayarak gerçekleştirmektedir. Farklı proteinler için denatürasyon sıcaklığı da farklıdır.

pH ile denatürasyon: Aşırı pH iç kısımlarda elektrostatik itmeye neden olmaktadır ya da amino asit yan zincirindeki yükleri değiştirerek iç kısımlardaki elektrostatik çekme kuvvetlerini yok etmektedir. Bunun sonucunda protein açılır.  Ve bağlanmış çözücü molekülleri uzaklaşır. Bu da denatürasyon ile sonuçlanır.

Organik çözücü ile denatürasyon: Organik çözücüler ile seçici denatürasyon, denatürasyonu arttırmak için, genellikle 20-30 °C’lerde gerçekleştirilir.

proteinlerin çöktürme özellikleri proteinleri çöktürme deneyleri,protein saflaştırılması.sütten ve etten protein eldesi protein çöktürme yöntemleri salting out tuz ile protein çöktürme

Devamı...

Operon Nedir?

•Gen ifadesinin transkripsiyon düzeyinde düzenlenmesi için operon modeli tanımlanmıstır.

•Operon, tek promotor’un kontrolu altında bulunan ve çok sayıda genin (cluster) ifadesini düzenleyen bir sistemdir.

•Operonda yer alan genler tipik olarak ortak bir metabolik yolda fonksiyon görürler.

•Ökaryotlarda bir protein molekülünün her alt ünitesi veya her bir polipeptit zinciri için ayrı ayrı mRNA’lar transkribe edilmekte, prokaryotlarda ise bir protein molekülünün tüm alt üniteleri veya tüm polipeptit zincirler için bir tek mRNA transkribe edilmektedir.

•Bir başka deyişle ökaryotlarda bir mRNA, bir polipeptit içindir; prokaryotlarda ise bir mRNA, birçok polipeptit zincir içindir.

•Bu nedenle ökaryotlar monosistronik olarak, prokaryotlar ise polisistronik olarak tanımlanırlar

•OPERON üzerinde RNA polimeraz bağlanma bölgesi ve cAMP+reseptör protein bağlanma bölgesi olmak üzere iki bölge içerirler.

Devamı...

Biyokimyanın Uygulama Alanları

Biyokimyanın temeli laboratuvar çalışmaları­na dayanır. Bu nedenle biyokimyacılar çok gelişmiş laboratuvar tekniklerinden ve aygıt­larından yararlanırlar. Örneğin dokulardaki bütün kimyasal maddeleri saptayıp ayırabilen spektrometre ve kromatograf gibi özel aygıt­lar biyokimyanın temel araçlarıdır. Böylece vücuttaki hormonlar ya da dokularda tutul­muş zehirli maddeler, başka hiçbir yöntemle saptanamayacak kadar az miktarda bile olsa bu aygıtlarla belirlenebilir. Canlı hücrelerin özel çözeltilere ya da pelte kıvamındaki özel besi ortamlarına “ekilmesine” dayanan doku kültürü de biyokimyanın en önemli teknikle­rinden biridir. Hücrenin bileşimi, çoğalma ve davranış özellikleri, enzim eksiklikleri, kro­mozom bozuklukları, kanser oluşumu, ilaçla­ra ya da mikroplara göstereceği bağışıklık tepkileri bu yöntemle anlaşılabilir. Hastalık yapıcı bakteri ve virüslerin özel besi yerlerin­de üretilmesine dayanan bakteri ve virüs kültürleri de mikroplardan ileri gelen birçok bulaşıcı hastalığın anlaşılmasına, tedavi ve bağışıklık yollarının bulunmasına yardımcı olmuştur. Hastanelerin biyokimya laboratuvarların-da, adli tıp kurumlarında, büyük tarım işlet­melerinde, haralarda ve karantina istasyonla­rında da biyokimyacılara önemli görevler düşer. Özellikle hastalardan alınan kan, id­rar, dışkı ve beyin-omurilik sıvısı gibi örnekle­rin biyokimya yöntemleriyle incelenmesi has­talıkların tanısında çok değerli ipuçları sağlar. Tarlalardaki ürünlerde ya da asma bağlarında bulaşıcı bir hastalık baş gösterdiğinde bu hastalığın etkenini saptamak, kriminolojide suçun işlendiği yerdeki bazı izleri, örneğin saç tellerini inceleyerek katilin kimliğini belirle­mek için de gene biyokimya yöntemlerine başvurulur. Yeni ilaçlann ve aşıların insan vücudundaki etkilerini araştırarak farmakolojiye yardımcı olan biyokimya günlük yaşamın birçok ala­nında önemli rol oynar. Yiyeceklerdeki katkı maddelerinin, tarımda kullanılacak gübrele­rin ve içme sularını arıtmak için katılan kimyasal maddelerin önce biyokimya yön­temleriyle sınanması gerekir. Radyasyonun canlı dokular üzerindeki et­kilerini incelemek için de gene biyokimya tekniklerinden ve aygıtlarından yararlanılır. Böylece, nükleer enerji santrallarından tele­vizyon ekranlarına kadar çok geniş bir alan­da, radyasyonun insan sağlığını tehlikeye atıp atmadığı denetlenebilir.

Devamı...

Rekombinant DNA teknolojisi

—Rekombinant DNA teknolojisi, doğada kendiliğinden oluşması mümkün olmayan, çoğunlukla farklı biyolojik türlerden elde edilen DNA moleküllerinin, genetik mühendislik teknolojisiyle kesilmesine ve elde edilen farklı DNA parçalarının birleştirilmesi işlemlerini kapsayan bir teknolojidir. Rekombinant DNA ise; bu işlem sonucu üretilmiş olan yeni DNA molekülüne verilen isimdir.

—Bu alanda yapılan işlemler, kısaca genlerin herhangi bir organizmadan alınarak üretilmesi (klonlama) ve üretilen genlerin gerek temel, gerekse uygulamalı araştırmalar için kullanılması olarak özetlenebilir.
Rekombinant DNA Teknolojisi
Aşamaları;

—Doku veya hücrelerden DNA izolasyonu.

—Genin elde edilmesi (DNA’nın belirlenen restriksiyon endonükleazlarla kesilmesi).

—Restriksiyon enzimleri ile oluşturulan DNA parçalarının vektörlerle birleştirilmesi. Rekombinant DNA molekülünün oluşturulması.

—Rekombinant DNA’nın konakçı hücreye aktarılması. Konakçı hücre içinde çoğalarak klonlarını oluşturması.

—Konakçı hücrenin çoğalarak rekombinant DNA molekülünü oğul hücrelere aktarması.

—Klonlanmış DNA’nın konakçı hücrelerden izole edilip incelenmesi.

—Klonlanmış DNA’nın gerekirse konakçı hücrede ifadelenmesi. İlgili proteinin tayin ve analizi.
DNA İzolasyonu;

  Temelde 3 aşamadan meydana gelir;

—Hücre duvarının parçalanması.

—DNA-Protein kompleksinin çözülmesi.

—DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması.

  Değişik organizmalardaki yapısal farklılıklar çeşitli izolasyon yöntemlerinin kullanılmasını gerektirebilir.

Devamı...

Tip 1 Diabet Mellitus ve insülin direnci biyokimyası nedir?

            İnsülin direnci, endojen salgılanan veya ekzojen verilen insülinin normalden daha az biyolojik yanıt oluşturması durumudur. insülin karaciğerde glukoneogenezi ve glikojenolizisi inhibe ederek hepatik glikoz üretimini baskılar. Ayrıca glikozu kas ve yağ dokusu gibi periferik dokulara taşıyarak burada ya glikojen olarak depolanmasını ya da enerji üretmek üzere okside olmasını sağlar.insülin direncinde kas ve yağ dokusunda insülinle uyarılan glikoz transportu ve metabolizmasında azalmanın yanı sıra hepatik glikoz üretiminin insülinle baskılanmasında bozulma olur. Bu durumda oluşan insülin direncini karşılayacak ve dolayısıyla normal biyolojik yanıtı sağlayacak kadar insülin salgısı artışı ile metalik durum kombinse edilir. insülin direnci bozulmuş glikoz toleransı ve diyabetin gelişmesinde majör rol oynar.

Obez bireylerde insülin direnci sık görülmektedir. Bununla birlikte normal glikoz toleranslı ve obez olmayan bireylerde ve esansiyel hipertansiyonlu hastalarda da insülin direnci görülebilmektedir. İlk olarak 1982’de Tip 1 diyabetli hastalarda insülin klemp tekniği kullanarak insülin direnci olduğu gösterilmiştir. Daha sonra yapılan başka çalışmalarda da Tip 1 diyabetli hastalarda benzer kontrol gruplarına göre belirgin insülin direnci olduğu gösterilmiştir. Bu hastalarda kronik hipergliseminin Tip 1 diyabetiklerde görülen insülin direncinden büyük ölçüde sorumlu olduğuna inanılmaktadır. Kötü kontrollü hastalarda iskelet kası kan akımındaki azalma, insülinin uyardığı glikoz alım hızında azalma ve hepatik insülin direnci saptanmıştır. Bunların yanında artmış kardiyovasküler risk faktörleri ve bel-kalça oranında artmanın insülin direncinin göstergeleri olduğu bildirilmiştir. Çocukluk çağındaki diyabetli hastalarda ise puberte sırasındaki büyüme hormonu düzeylerinde normal adolesanlara oranla daha fazla bir artış ve “İnsülin Like Growth Factor-1” düzeyindeki düşüş ile insülin duyarlılığında azalma olduğu düşünülmektedir.

           Tedavide metformin ve glitazonlar ile ilgili faydalı oldukları yönünde yapılmış çalışmalar mevcuttur. Sonuç olarak insülin direncinin tanısı diyabet regülasyonuna pozitif yönde etkili olabilir. Özellikle vücut kitle indeksi 30 ve üzerinde olan ve yüksek insülin ihtiyacı, hipertansiyon ve hiperkolesterolemi gibi insülin direnci belirteçlerinin bulunduğu Tip 1 diyabetli hastalarda insülin direncine yönelik tedavi fayda sağlayabilir.

Devamı...

Biyokimya ve Klinik Biyokimya Nedir ?

Biyokimya Nedir ?

Klasik bir tarife göre biyokimya, canlı organizmaların kimyasal yapısını ve hayatın devamı boyunca canlının içinde meydana gelen kimyasal olayları konu olarak ele alan ve inceleyen bir bilim dalıdır. Tıp ve sağlık bilimlerini de kapsamına alan biyoloji bilimi çok karmaşık ve komplike problemler içermektedir. Biyokimya bilim dalı ise deneysel metodlar ve aletler kullanarak bu sorulara ve problemlere çözüm aramaktadır.

2. Biyokimya Çalışma Alanı?

Bir biyokimyacının çalışma alanı nedir diye sorulacak olursa; “biyokimyacı, kimyasal, fiziksel ve biyolojik araç ve yöntemleri kullanarak canlı organizmanın yapısını ve hayatın devamı boyunca vücutta meydana gelen kimyasal değişimleri ortaya çıkarmak ve açıklamak için çalışan araştırıcıdır.” demek mümkündür.

Sonuç olarak biyokimya bilimi, yaşamın en küçük birimi olan hücrenin kimyasal yapısını, canlı- nın meydana gelişindeki, hayatının devamındaki ve nihayet yok oluşundaki kimyasal mekanizmaları konu olarak ele alan ve inceleyen bir bilimdir. Canlı meydana geldikten sonra hayatın devamı boyunca onun vücudunda meydana gelen olayların hepsine birden metabolizma adı verilmektedir. Bu nedenle biyokimya büyük oranda metabolizma ile ilgilenmektedir. Bununla beraber bazı anormal patolojik koşullar altında metabolizmada görülen ayrıcalıklar, yalnız has- talıkların teşhisinde görülen ayrıcalıklar, yalnız hastalıkların teşhisinde rol oynamakla kalmayıp, aynı zamanda normal olayların daha derinliğine aydınlatılmasına da ışık tutacaktır.

3. Biyokimyanın Tarihçesi

Biyokimya oldukça genç bir bilim dalı olup başlangıcından bugüne kadar yaklaşık 150 yıl gibi kısa bir zaman geçmiştir. 1903 yılına kadar hiç kullanılmamış olan biyokimya deyimi, ilk defa bu yıllarda Alman kimyageri Carl NEUBERG tarafından kullanılmıştır. Bununla beraber biyokimya alanında yapılan çalışmaların başlangıcı bu tarihten önceki yıllara rastlamaktadır. Biyokimya daha eski bilim dalları olan organik kimya, fizyoloji, biyoloji ve tıbbın gelişmesi ile günden gü- ne daha fazla değer kazanmıştır. İsveç Kimyageri olan Karl SCHEELE’nin 1700′lerin ortalarına rastlayan yıllardaki bitki ve hayvan dokularının kimyasal bileşimi konusundaki çalışmaları, biyokimyanın ayrı bir disiplin halinde kurulmasına neden olmuş ve biyokimyaya çok önemli katkılarda bulunmuştur.

WOHLER’in 1820 yıllarında üreyi kimya laboratuvarında sentez etmesi biyokimya tarihinde bir dönüm noktası olmuştur. Çünkü bu buluş organik moleküllerin yalnız canlılarda bulunduğuna inanılan ve adına vital güçler denen bir kuvvet tarafından sentezleneceği inancının yıkılmasına neden olmuştur. Başlangıçta parça parça ve basit olarak elde edilen bilgilerin toplanması ile biyokimya bağımsız bir bilim dalı olarak gelişmiştir. Biyokimyaya 1800 yılları sonuna kadar bazen fizyolojik kimya, bazen de patolojik kimya adları da verilmiştir. Bu tarihten başlayarak 1900 yılları başlangıcına kadar yapılan öncül çalışmalarla biyokimya alanında ilerlemeler kaydedilmiştir.

Biyokimya alanında en büyük atılımlar 1820 lerden sonra olmuştur. HARDEN ve YOUNG ile EMBDEN MAYERHOF’un karbonhidratların ara metabolizması konusundaki çalışmaları bu dönemin biyokimya konusunda en başarılı örnekleri olmuştur. KREBS ve diğerlerinin trikar-boksilik asit döngüsü konusundaki buluşları ve W.CROSE’un amino asitler konusundaki klasik çalışmaları bu devrin dikkate değer araştırmalarıdır. İkinci Dünya Savaşı sonrasındaki yıllarda biyokimya alanında inanılmaz ilerlemeler kaydedilmiştir. Bu dönemlerden sonra biyokimya alanındaki bilgilerin her sekiz yılda bir yüzde yüz arttığı kabul edilmektedir. Bilim dünyasının moleküler düzeydeki çalışmalara büyük ilgi göstermesi biyokimyayı en dinamik ve en fazla bu- luşların yer aldığı bir alan haline getirmiştir. Çok hassas ve özgül kromotografik metodların 1950 yıllarında geliştirilmesi ile çok küçük miktarlardaki biyolojik moleküllerin saflaştırılmasına ve yapılarının aydınlatılmasına olanak sağlanmıştır. Radyoaktif izotoplarla işaretlenmiş bileşiklerin canlılara verilmesi ile bu bileşiklerin uğradığı değişiklikleri ve takip ettiği metabolik yolları izlemek mümkün hale gelmiştir. Son yirmi yıldaki baş döndürücü ve inanılmaz gelişmeleri anlatabilmek için bu dönemde yapılan çalışmalardan bazı örnek vermek gerekmektedir.

Glikoz, amino asit ve yağ asiti metabolizmasındaki biyosentez ve yıkım yollarının aydınlatılması konusunda yapılan çalışmalarla modern görüşlerin ortaya çıkması, steroid hormonlar ve kolesterol biyosentez yolunda yapılan yenilikler, biyolojik bakımdan önemli olan bazı proteinlerin yapılarının aydınlatılması bu devrin en başarılı çalışmalarından bazılarıdır.

1953 yılında I.D.WATSON ve F.CRİCK, DNA’nın yapısını aydınlatarak protein sentezinde çok önemli ilerlemelerin olmasını sağlamışlardar. Daha sonraki yıllarda çok parlak keşifler olmuş- tur. MAXAM ve GILBERT’in geliştirdiği kimyasal yöntemle DNA’nın yapısı bütün ayrıntıları ile belirlenmiştir. Bu sayede hem çeşitli DNA moleküllerinin daha detaylı incelenmesi mümkün ha- le gelmiş hem de gen mühendisliği dediğimiz yeni bir alan doğmuştur. Gen mühendisliği yöntemi ile, bir canlıdaki geni, bir başka canlıya transfer etmek ve çeşitli amaçlar için kullanmak mümkün hale gelmiştir. İnsan büyüme hormonu ve insan insülin hormonu geni, insan hücresinden bakterilere nakledilmiş olup, bu iki hormon bakteriler tarafından sentezlenmekte ve her iki hormon da bol miktarda elde edilmektedir. Gelecek yıllarda da bu tür keşiflerin dinamik bir alan olan biyokimya dalında yapılacağını söylemek mümkündür.

Biyokimya, canlı organizmaların kimyasal yapısını ve hayatın devamı boyunca canlının içinde meydana gelen kimyasal olayları konu olarak ele alın bilimdalıdır.

Biyokimyacı, kimyasal, fiziksel ve biyolojik araç ve yöntemleri kullanarak canlı organizmanın yapısını ve hayatın devamı boyunca vücutta meydana gelen kimyasal değişimleri açıklamak için çalışan araştırıcıdır. Canlının hayatı boyunca vücudunda meydana gelen kimyasal olayların tümüne metabolizma adı verilmektedir.

Devamı...

Biyokimya laboratuvar eğitimi: multi-disipliner yaklaşım

Deneysel bir bilim dalı olan biyokimya dersi ve buna bağlı biyokimya laboratuvarı uygulamaları ülkemizde üniversitelerin tıp, eczacılık, diş hekimliği, veteriner hekimlik, biyoloji, kimya, gıda mühendisliği, çevre mühendisliği, orman mühendisliği, ziraat mühendisliği, sağlık bilimleri fakültelerinin farklı bölümleri ile yüksek okulların ilgili bölümlerinin lisans eğitiminde zorunlu ders olarak öğretilmektedir. Biyokimyanın disiplinler arası özelliği, fizyoloji ve kimya ile ilişkili olması ve son yıllarda moleküler biyoloji, moleküler genetik ve nanobilim ile giderek alanını genişletmesi Biyokimya ve Biyokimya Laboratuvarı Eğitiminde yeni yaklaşımları gündeme getirmiş ve güncellenmiş uygulamalara ve öğretim yöntemlerine ihtiyaç duyulmuştur. Karşılaşılan sorunlar ve çözüm önerileri, değişik programlar arasında eşgüdümün sağlanması ve alanların amacına uygun teorik ve uygulama eğitiminde standardizasyona ulaşılması, Avrupa Birliği uyum sürecinde gerekli altyapının tanımlanması gerekmektedir.

Mevcut durumda her eğitim kurumunda farklı düzeylerde, belirli konulardaki deneylerle sınırlı laboratuvar föyü ve kitapçıkları bulunmaktadır. Dünyada 20. yüzyılın son çeyreğinde hızlanan bilgiye dayalı küresel ekonomik yarış ile birlikte bilişim ve iletişim teknolojilerinde yaşanan önemli gelişmeler, ülkeleri yüksek öğretim alanında  mevcut  sistemleri  yeniden  değerlendirmeye ve gelişmeler ışığında yeniden yapılandırmaya yöneltmiştir. Bu değişim özellikle, yüksek öğretim ve araştırmada giderek rekabet gücünü kaybeden ve son yıllarda dinamik, etkin bir bilgi toplumu ve ekonomisi olmayı hedef leyen Avrupa düzeyinde Lizbon ve Bologna Süreçleri ile önemli bir hız kazanmıştır. “Lizbon Tanıma Sözleşmesi” (1997),  Türkiye’de 2007 yılında yürürlüğe girmiştir(http://bologna.yok.gov.tr/?page=yazi&i=69). Türkiye’nin Bologna Sürecine (1999) üyeliği 2001 yılındadır (http://bologna.yok.gov.tr/). Bu süreçler çerçevesinde Türkiye’de yüksek öğretim sistemleri yeniden gözden geçirilmekte, yeniden yapılandırılmakta ve yeni yeterlilikler Avrupa Yeterlik Çerçevesi ile ilişkilendirilerek tanımlanmaktadır.

T.C. Yükseköğretim Kurulu (YÖK) web sitesinde yeterlilik: “Yüksek öğretim alanında yeterlilik, herhangi bir yüksek öğretim derecesini başarı ile tamamlayan bir kişinin neleri bilebileceği, neleri yapabileceği ve nelere yetkin olacağını ifade eder” olarak tanımlanmaktadır. Türkiye Yükseköğretim Yeterlilikler Çerçevesi (TYYÇ,

Türkiye Yükseköğretim Ulusal Yeterlikler Çerçevesi (TYUYÇ) kapsamında lisans, yüksek lisans ve doktora seviyeleri için öğrenme çıktıları, EQF-LLL düzey tanımlayıcıları kullanılarak, her bir yükseköğretim düzeyinin, ilgili temel düzeyde verilen diplomaların (derecelerin) öğrenme çıktılarını (kazanımlarını) kapsayacak şekilde genel olarak tanımlanması ve ilgili düzeylerde verilen diploma (derece) türlerinin belirtilmesi benimsenmiştir. Bu yaklaşım uygulamadaki kolaylığı ve esnekliği nedeni ile birçok Avrupa ülkesinde tercih edilmektedir. Önlisans programları dâhil diğer mesleki yeterlik düzeylerinin tanımlanması çalışmalarına YÖK ve ilgili kurullar devam etmektedir.

“Avrupa Yeterlikler Çerçeveleri” ve bu çerçeveler ile ilişkilendirilmiş “Ulusal Yeterlikler Çerçeveleri (UYÇ)”dir. Bu yeterlikler çerçeveleri ile Avrupa Yükseköğretim Sistemleri arasında karşılaştırılabilirlik ve şeffaf lığın sağlanması, öğrencilerin ve öğretim elemanlarının yükseköğretim sistemleri içinde ve arasında hareketliliğinin kolaylaştırılması, öğrenme çıktıları, kredi ve iş yüküne dayalı  eğitim  programları  ve  modüllerinin  geliştirilmesi için yükseköğretim kurumlarının teşvik edilmesi, yükseköğretim yeterlikleri ile yaygın ve resmi olmayan öğrenme, tecrübe yoluyla kazanılmış yeterliklerin tanınması ve yaşam boyu öğrenimin yaygınlaştırılması öngörülmektedir [1].

“ISCED 97, EUROSTAT&CEDEFOP EĞİTİM VE ÖĞRETİM ALANLARI” (http://tyyc.yok.gov.tr/?pid=37) “YAŞAM BİLİMLERİ, kodu:42” altında biyokimyaya özel önem verilmekte ve 421 kodlu “Eğitim ve Öğretim Alanları”nda Biyoloji ile birlikte yer almaktadır. Ülkemizde Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyokimya Bölümü, Cumhuriyet Üniversitesi Biyokimya Bölümü ve Selçuk Üniversitesi ABD Montana Üniversitesi ile ortak çift diplomalı Biyokimya seçenekli Bölümü bulunmaktadır.

Ülkemizde 1988 yılında yapılan ve daha sonra değişik aralıklarla düzenlenen biyokimya eğitimine yönelik çalıştay, sempozyum ve toplantılar mevcuttur. Bu toplantılar ve tartışılan konu başlıkları Tablo 1’de verilmiştir. Tablo 1’de de çok net görüleceği gibi geçen süre zarfında problemler büyük ölçüde devam etmektedir [2-4]. Ankara’da 2012 yılında düzenlenen çalıştayın son gününde farklı disiplinlerin biraraya gelerek oluşturduğu bildirge, sekiz temel başlıktan oluşmaktadır. Bu bildirge eğitimdeki sorunları ve biyokimya laboratuvar eğitimi için olması istenen çekirdek programı içermektedir. Çalıştayda tartışılarak sonuç bildirisinde özetlenen kararlar/öneriler şunlardır:

 Altyapı eksiklikleri ile ilgili sorunlar ve çözüm önerileri

Mekan sorunu: Biyokimya laboratuvar dersi uygulamalarının yapıldığı laboratuvarların büyüklüğü öğrenci sayısının fazla olmasından dolayı uluslararası laboratuvarda 24-25 öğrenci/110 m2 standardına uyulamadan; ancak öğrenci sayısının azaltılma imkanı olamadığından, gruplara bölünerek yapılmaktadır. Ayrıca ekipman ve çeker ocak eksiklikleri vardır. Bunları eski üniversitelerde ek yaparak düzeltmek daha zorken, yeni üniversitelerde baştan standardlara uygun ve güvenli laboratuvarlar yapılabilir.

Atık sorunu: Laboratuvarlarda 200 L’lik atıklar için nötralizasyon ünitesi gereklidir. Bu üniteler hastanelerde bulunmasına rağmen, tıp fakültelerinde genellikle bulunmamaktadır. Bu da hastane ile protokol yapılarak atıkların bertarafını gerektirmektedir. Katı atıklar ve mikrobiyolojik olarak tehlikeli atıklar (otoklavlandıktan sonra) belediyeler tarafından tıbbi ve/veya tehlikeli özel atık olarak toplanarak bertaraf edilmelidir. Biyokimya ve moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın kullanılan toksik madde etidyum bromür atıkları plastik şişelerde toplanarak bertaraf edilmelidir.  Bazı örnekler: Balıkesir Üniversitesi örneğinde fenol, toluen, dimetil sülfoksit Balıkesir Belediyesi ile Üniversite arasındaki anlaşma kapsamında belediye tarafından toplanıp gömülmektedir. Alkollü ve gümüşlü çözücüler ise dibinde toprak bulunan varillerde toplanmaktadır. Belli miktardaki organik çözücüler ayrı kaplarda toplanıp FenEdebiyat Fakültesi Kimya Bölümüne teslim edilmekte; Bölüm bu atık çözücüleri dönem sonunda ayrıştırıp saflaştırmaktadır, geri kazanılan çözücüler yeniden kullanılabilmektedir.

Öğretim elemanlarının etkin laboratuvar eğitimi sağlamalarındaki  yeterlilikleri

Üniversitelerde ülke genelinde kadrolarda yetişmiş öğretim elemanı sıkıntısı olduğu bilinmektedir. Kadro problemleri öğretim üyesinin memnun olarak işe başlamasını engellemekte; bu durum diğer derslerde olduğu gibi biyokimya alanında da problem olarak karşımıza çıkmaktadır. Biyokimya laboratuvarından sorumlu öğretim üye ve yardımcılarının gerekli mesleki bilgi, beceri ve yeterlilik donanımına sahip olmaları beklenmektedir. Bologna sürecinde günün gereğine göre ders açılması öngörüldüğü halde, yer yer derslerin öğretim elemanına göre açılması; başka alanlardan görevlendirilen öğretim elemanlarının biyokimya laboratuvar uygulamalarını yürütmede yetersiz kalmaları ve bazan yeterliliklerinin uygun olmaması gibi zorluklarla karşılaşılmaktadır. Bu problemler “Eğiticilerin Eğitimi” ve “hizmet içi uyum eğitimi” ile çözülebilecektir. Bu hedefe ulaşmak için bütün bilim dallarının katılımı ile bu çalıştay benzeri etkinlikler ve ileri kurslar düzenlenebilir. Esas problem, dersin sorumlu öğretim üyesinin biyolojik ve biyokimyasal kavramları (kavram yanılgısı yaşam bilimlerinde çok fazladır) eksik kavraması ve dolayısıyla öğrenciye de yanlış aktarmasından kaynaklanabilmektedir. Ayrıca farklı alanlardan gelen öğretim üye ve yardımcılarının laboratuvar güvenliği hakkında bilgi sahibi olmaları (GLP dâhil); özel çalışma alanlarına ait sertifikasyonların  tamamlanması  beklenmektedir.  Laboratuvar uygulamalarında modern tekniklerin kullanılması; güncel yöntem ve tekniklere programda yer verilmesini sağlanmalıdır. TYYÇ kapsamında öğrencinin aktif katılımının olacağı bir öğretim yönteminin seçilmesi öngörüldüğünden öğretim elemanları söz konusu yaklaşımları tercih etmelidir.

Sorumlu öğretim üyesi ve uygulamaları yaptıran öğretim elemanları (bazı kurumlarda lisansüstü öğrenciler ve tıpta uzmanlık öğrencileri de görevlendirilmektedir) pedagojik formasyon becerilerine sahip olmalıdır. Bunun için akademik kariyerde ilerleyen öğretim kadrosunun pedagojik formasyon ile desteklenmesi, hatta gerektiğinde bu konuda eğitim almalarında fayda vardır. Çalıştayda kadrolardaki sınırlamalar ve yetişmiş öğretim kadrosundaki eksikliklerden dolayı laboratuvar öğretiminin yürütülmesinde zorluklar bulunduğu, zaman zaman Türkiye’de tartışılan “öğretim üyeleri araştırmacı ve öğretici olarak ayrı iki grup olabilir” konusunun yeniden gündeme alınması da görüşülmüştür. Bütün pratik/uygulama derslerinde olduğu gibi biyokimya laboratuvarında da dersin sorumlu öğretim üyesinin yönlendiriciliği kaçınılmazdır. Öğretme sorumluluğu kendisinde olduğundan, araştırma görevlileri eğitim sürecindeyken eksiklikleri hoca kontrol etmeli ve yürütmelidir. Deney ön hazırlıklarının çok iyi yapılması, bütün ayrıntıların gözden geçirilmesi ve başarılı deneylerin seçilmesi de sorumlu öğretim üyesinin sorumluluğundadır. Dersin öğretim üyesi uygulamayı sadece araştırma görevlilerine bırakmamalı; uygulamalara girip işin içinde olmalıdır. Oluşan problemlerin (deneylerden beklenen sonucun çıkmaması, teknik veya yöntemin çalışmaması gibi) çözümünü birlikte yapmalı ve sonuçları diğer öğretim elemanları ile tartışmalıdır. Bu bağlamda her ne kadar araştırma görevlisinin bağımsız olmayı öğrenmesi bekleniyorsa da bilimsel metodu öğrendikten sonra problem çıktığında veya yeniliklerin uygulanmasını talep ettiğinde sorumlu öğretim üyesine sorup danışabilmelidir; aynı zamanda bazı çözülebilecek problemleri kendilerini yetiştirerek çözebilmelidirler. Bazı katılımcılar örnek vererek; kendileri yeni asistan olduklarında uygulamaları hazırlamakta zorlandıklarını, önce kendilerinin deneyleri yaparak denediklerini, ancak derste sonuç beklendiği gibi çıkmadığında hocaya sormaya çekindiklerinden öğrencilere mahcup olduklarını anlattılar. Diğer taraftan öğrencilerin “Olmayan veya çıkmayacak deneyi neden bize getirdiniz?” şikayetinde bulunarak büyük çoğunlukla sadece uygulamaları yürüten öğretim elemanını suçladığını belirttiler. Bu durumda araştırma görevlisi yerine dersin asıl sorumlusu olan öğretim üyesi değerlendirmelidir. Biyokimya laboratuvar eğitiminde devamlılık için her uygulama/deney veya kullanılıyorsa modül için “föy/çalışma yaprakları” deneyin bütün detaylarını içerecek tarzda hazırlanmalıdır. Deneye başlamadan önce ise işlemleri kolaylaştırıp kontrol etmek amacıyla adım adım yazılmış bir kullanma kılavuzu (checklist) kullanılabilir.

Ekipman ve sarf malzemesi temininde zorluklar ve idarelerin sorumluluğu

Biyokimya laboratuvarında deneylerin yapılmasında cihaz, ekipman ve diğer malzemelerin temininde zorluklarla karşılaşılmaktadır. Eğitim kurumlarında idare, her birimin (fakülte/yüksek okul) sarf malzemesi ödeneği olmasına rağmen (normal ve ikinci öğretim öğrenci harçlarının kullanım alanları Rektörlük tarafından belli alanlardaki harcamalara kullanılabilmektedir), söz konusu ödenekleri ve kullanım amaçlarını bölümlere bildirmediğinden öğretim elemanları talep etmeleri gerektiğinden habersizdir ve ödenekler kullanılamamaktadır. Her ne kadar üniversitelerin BAP (Bilimsel Araştırma Projeleri) birimlerinden proje (altyapı veya eğitim projesi yazılarak) malzeme temin edilebilirse de asıl olan bütçe kaynaklarının amacına uygun kullanımıdır. Bununla ilgili olarak aşağıda Çalıştay katılımcılarına ve diğer yararlanıcılara malzeme temini ve bütçe konularında faydalanabilecekleri bazı bilgiler verilmiştir: “Bütçe Mevzuatı”, “Bütçe Çağrısı” ve “Bütçe Hazırlama Rehberi Analitik Bütçe Sınıf landırması” ile ilgili rehberler T.C. Maliye Bakanlığı,  Bütçe ve Mali Kontrol Genel Müdürlüğü’nün (http://www.bumko.gov.tr) adresinde sol menüde “Bütçe” başlığı altında mevcuttur. Ayrıca sol menüde “Mevzuat” başlığı altındaki rehberde harcamaların hangi kodlara göre yapılacağı bulunmaktadır. Laboratuvar  uygulamalarına  “malzeme  alacak  ödeneği bulunmadığını” belirten idarecilerden talep edilecek malzeme  için,  bütçe  ödeneklerine  29.12.2011  tarihli Resmî   Gazete’nin   (http://www.resmigazete.gov.tr/de-fault.aspx) 1. Mükerrer sayısından, metin bölümünün sonundan kurumların bütçelerinden ulaşılabilmektedir.

Öğrencilerin hazır bulunuşlukları ve yeterlilikleri

Biyokimyanın zor bir bilim dalı olarak algılanması ve öğrencilerin teorik ve pratik derslere önyargılı gelmeleri baştan öğrenme ile ilgili olumsuz şartlar oluşturabilmektedir. Biyokimya laboratuvar dersini alan öğrencilerin belirli bir bilgi ve olgunluk düzeyinde olmaları beklenmektedir. Ancak orta öğretimden ve test sisteminden gelen önemli problemler vardır. Sağlık hizmetleri meslek yüksek okullarına gelen öğrencilerin hazır bulunuşluk seviyelerinin düşük olması (meslek lisesinden not ortalaması ile doğrudan geçiş yapılmaktadır) uygulamalarda zorluklara ve başarının düşmesine neden olmaktadır. Bologna süreci ve dünyada yeni eğitim yaklaşımları ile öğrencilerin pratikleri bizzat yapmaları; uygulamalara aktif katılmaları beklenmektedir. Öğrencilerin yabancı dil yetersizlikleri bilimsel araştırma motivasyonlarını, pasif duruma geçerek sadece alacakları ünvanla ilgilenmeleri de başarılarını olumsuz etkilemektedir.

Öğretim materyallerinin temini

Biyokimya laboratuvar dersi için Türkçe kaynak kitap yok denecek kadar azdır. Biyokimyada işitsel ve görsel ders materyali önemli olduğundan video, slayt, animasyonlar ve sanal laboratuvar çok faydalıdır.

Biyokimya  Laboratuvar   Eğitimi   Çekirdek Programı

Bu programın amacı; önlisans ve lisans öğrencilerini biyokimya laboratuvarının önemi, uygulama alanları ve disiplinler arası özellikleri hakkında bilgi sahibi yaparak; onları çalışma hayatında ve bilim alanında ihtiyaç duyulan bireyler olarak yetiştirmektir. Aynı zamanda önlisans ve lisans öğrencilerinin güvenli, ucuz, duyarlı, çabuk ve az hatalı deneyler yapmalarını sağlamaktır. Programın bir diğer amacı da öğrencilerin alanla ilgili teorik bilgileri ve laboratuvar deneyimlerini eş zamanlı olarak kazandırmak; aynı zamanda Bologna sürecinde ülkemizin yükümlülüklerinin yerine getirilmesi ve diploma harmonizasyonunun sağlanmasıdır.

Öğrenme-Öğretme Süreci: Her laboratuvar dersi için teorik ve uygulama ayrımı yapılabilir ve dersler önce teorik bilgilerin verilmesi ve sonrasında deneyin yapılması şeklinde düzenlenebilir. Biyokimya Laboratuvar Eğitimi Çekirdek Programı için öğrencilerin temel kimya (özellikle organik ve fizikokimya alanlarında temel bilgi birikimi gerekmektedir) laboratuvarını önkoşul olarak tamamlamış olması gerekmektedir. Öğrenciler ayrıca matematik becerilerine, canlıların biyolojik özellikleri ve temel fizik laboratuvarı konularında temel bilgilere sahip olmalıdır. Biyokimyasal hesaplamalar ve cam malzemelerin temizliği konuları hatırlatma amacıyla ayrı laboratuvar uygulama ders saati harcanmadan, kaynak kitapçık (föy, modül) veya PDÖ gibi yöntemlerle öğrencilere verilmelidir.

Değerlendirme: Eğitim kurumunun ve dersin özelliğine göre farklı ölçme ve değerlendirme teknikleri kullanılarak öğrencilerin başarıları konusunda yargıya varılacaktır. Programda yer alan bilgi ve becerilerin değerlendirilerek, gelişmeler ışığında güncellenmesi ve yenilenmesi yapılacaktır.

 Çekirdek laboratuvar programı ve ilaveler dışında bilimsel araştırma projeleri: Bitirme projesi (özel çalışma) dersi, yaz stajları gibi öğrencilerde bilime karşı merak ve ilgi uyandıracak faaliyetler de sunulabilir. Programdaki zorunlu biyokimya laboratuvar dersi dışında; öğrencilerin staj ve uygulama istek ve başvuruları birçok alanda kabul edilmemektedir. Öğrencilerin çoğunluğu bu durumda laboratuvar dersi dışı faaliyetleri yapamamaktan, bazıları ise fen ve fen-edebiyat fakültesinden öğrencilerin tıp fakültelerinde staj yapma taleplerinin kabul edilmediğinden şikayet etmektedir. Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesinde ise biyokimyaya ilgi duyan tüm öğrencilerin staj talepleri kabul edilmektedir; hatta zaman zaman lise öğrencilerine de bu imkan tanınmaktadır. Öğrencilerin bitirme projelerini öğrenci kongresi, bilim şenliği ve benzeri projeler ve faaliyetlerde sunulması desteklenebilir (Marmara Üniversitesi, Tıp Fakültesi örneği). Öğrencilerin hepsi olmasa da başarılı ve istekliler küçük araştırma projelerine katılabilir ve bu ders olarak kabul  edilip  değerlendirilebilir.  Balıkesir  Üniversitesi, Tıp Fakültesi örneğinde ise kliniğe geçen öğrenciler öğrenci bilimsel araştırma topluluğu kurmak ve öğrenci kongresi yapmak istemişlerdir. Bazı eğitim kurumlarında (Balıkesir Üniversitesi, Biyoloji Bölümü, Hacettepe Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü ve Gazi Üniversitesi,  Gazi  Eğitim  Fakültesi,  Biyoloji  Eğitimi ABD örnekleri) öğrenciler bitirme projesi dersini öğretim üyesinin yürümekte olduğu bilimsel araştırma projesinde çalışarak yapmakta ve iş hayatında bunun çok faydalı olduğunu bildirmektedirler. Ayrıca TÜBİTAK “2209-Üniversite Öğrencileri Yurtiçi/yurtdışı Araştırma Projeleri Destekleme Programı” kapsamında lisans düzeyinde öğrenci projesi desteği vermektedir (http://www.tubitak.gov.tr/sid/524/pid/453/cid/25905/index.htm).

Özel Sektör ve biyokimya laboratuvar eğitimi Biyokimya tahlil ve araştırma laboratuvarlarında değişik meslek gruplarından elemanlar ve yöneticiler çalışmaktadır. IVF laboratuvarları, embriyoloji ve moleküler biyoloji  yöntemleri  için  yetiştirilmiş  elemana  ihtiyaç duymaktadır. T.C. Millî Eğitim Bakanlığı ile T.C. Yükseköğretim Kurumu arasında T.C. Sağlık Bakanlığı ile olana benzer bir sigorta anlaşması yapılması gerekmektedir. Stajın mesleğin çok önemli bir parçası olmasından dolayı öğrencilerin staj sayılarının arttırılması, bilgi ve becerilerinin gelişmesi için gerekli bir önkoşul niteliği taşımaktadır. Özel sektör stajı desteklemekte ancak uygulama hastaneleri yeterli sayıda stajyer kabul etmemektedir. Bu sorunun giderilebilmesi için Eğitim ve Mühendislik Fakültelerinde olduğu gibi tanımlanmış ve yapılandırılmış staj programlarının eğitim programlarının içine dahil edilmesi gerekmektedir.

Çalıştay sonucunda mevcut durumda farklı bilim dallarında aynı başlık altında farklı bilimsel içerik ile yürütülmekte olan biyokimya laboratuvar eğitimine kalite güvencesinin sağlanmasına yönelik olarak: Daha önce yapılan çalışma ve toplantılar da dikkate alınarak çekirdek laboratuvar eğitimi programı oluşturulmuştur. Çalıştaya genç bilim adamları ve lisansüstü öğrencilerin de katılımı ile ülkemiz bilim altyapısının güçlenmesine ve bilim adamı yetiştirilmesine katkı vermeleri, tecrübeli bilim adamları ve eğitimcilerle tartışarak biyokimya laboratuvarında çalışma kültürleri ile bilimsel düşünme yeteneğinin geliştirilmesinde olumlu adımlar atılmıştır.

Devamı...

Protein Mühendisliği Uygulamaları

Bir protein mühendisliği uygulamasında amaç;

1.     •Yüksek öneme sahip kimyasalların üretimini katalizleyecek  üstün özelliklere sahip enzimlerin üretimi;

2.     •Yüksek miktarda enzim üretimi

•Üstün özelliklere sahip biyolojik bileşiklerin( sentetik peptidler, sentetik ilaçlar  v.s) üretilmesi   şeklinde olabilmektedir.

•       
Bir proteinde ne gibi özelliklerin değiştirilmesi amaçlanabilir?

Vmax değerinin artırılması

•        Km değerinin düşürülmesi      

•        Bir inhibisyon merkezinin eliminasyonu

•        pH optimumun değiştirilmesi

•        Reaksiyon spesifikliğinin değiştirilmesi

•        Kararsızlığa neden olan artıkların eliminasyonu

•        Termal kararlılığın artırılması

•        Organik çözücülerde kararlılığın artırılması

•        Fizikokimyasal özelliklerinde değişmeler

•        Ligand bağlama spesifikliğin modifikasyonu

•        Kimerik ve çok fonksiyonlu proteinler

•        Saflaştırma için etiket eklenmesi

•        Terapötik ajanların etkinliğinin artırılması

   Protein Mühendisliği Yöntemleri

Protein mühendisliği çalışmalarında sıklıkla karşımıza çıkan iki genel yöntem ‘’rasyonel dizayn’’ ve ‘’yönlendirilmiş evrim’’ dir.

Bu iki yöntem dışında proteinlerin kimyasal ve biyolojik modifikasyonlarından da söz edilebilir.

Kimyasal modifikasyon

— Proteinlerin kimyasal modifikasyonu  yan zincirdeki fonksiyonel gruplar, N ve C terminal üzerinden kovalent bağ oluşumu ve peptid bağının parçalanmasıdır.

— Bu bağlamda genel olarak proteinlerin çapraz bağlanması, kovalent immobilizasyonu ve yan grupların spesifik olarak modifikasyonu ya da işaretlenmesi söz konusu olabilir.

-        Bifonksiyonel çapraz bağlayıcılar(formaldehid,glutarladehid gibi) ile çapraz bağlama

-Sefaroz gibi polimer karakterdeki taşıyıcılar ile kovalent immobilizasyon,

-        Arg,  Asp, Glu, His, Lys, Trp, Cys ve Met artıklarının spesifik reaktifler kullanılarak seçimli bir şekilde modifiye edilmesi,

-        Proteinlerin  izlenmesi ve araştırılması amacıyla yan grupların spesifik olarak etiketlenmesi çalışmaları;

                  1) Floresans etiketleme

                  2) Spin etiketleme

                  3) Afinite etiketleme ve

                  4) Fotoafinite etiketleme

       

      Biyolojik modifikasyonlar

insan genomunda 500 protein kinaz, 150 fosfoprotein fosfataz, 500 proteaz, >100 ubikitinleyici ligaz ve >50 deubiktinleyici enzim bulunmakatadır. Yaklaşık olarak 1000 ila 2000 civarında genin posttranslasyonel modifikasyonlarda yer alan enzimleri kodladığı düşünülmektedir.

    Protein yan zincirinin proteolizi, fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon, glikozilasyon, prenilasyon gibi modifikasyonlar sonucu  protein çeşitliliği artırılabilmektedir.

Rasyonel Dizayn

    Rasyonel dizayn, protein dizisinde  önceden tasarlanmış bir değişikliğin bölge yönlendirilmiş mutagenez ile gerçekleştirilmesidir.

 

    Rasyonel dizayn çalışmalarında nokta mutasyonu, insertion ve deletion gibi birtakım mutasyonların gerçekleştirilebilmesi için sıklıkla kullanılan yöntem

Overlap Extension PCR.

    Enzimin yapı-fonksiyon ilişkisi ve stabilitesine etki eden faktörler henüz tam olarak aydınlatılabilmiş olmaması ve spesifik bir mutasyonun enzim 3D yapısına ve  karakterine ne şekilde etki edeceğini tahmin etmenin oldukça zor olması yöntemin en önemli dezavantajı olarak kabul edilir.

Yönlendirilmiş Evrim

    Yönlendirilmiş evrim çalışmalarında modifiye protein elde etmek amacıyla rasgele mutagenez( random mutagenesis) teknikleri kullanılır. Bir yönlendirilmiş evrim çalışması genel hatlarıyla şu dört basamaktan oluşur;

  1) Modifiye edilmek istenen proteine ait gen dizisi seçilir ve mutagenez yöntemleri ile dizi çeşitliliği oluşturulur.

  2) mutant DNA dizileri bir taşıyıcıya bağlanır(ligation) ve  konukçu hücreye transformasyonu ardından protein expresyonu induklenir.

  3) istenen kabiliyet ya da özelliklere sahip transformantların seçimi için bir tarama prosedürünün yürütülmesi.

  4) Seçilen dizinin çoğaltılması sonrası, arzu edilirse, mutagenez ve tarama işlemleri birkaç kez tekrarlanarak daha ideal bir sonuç elde edilebilir. Genellikle  altı döngülü bir çalışmada arzu edilen özelliklere sahip bir protein elde edilebilir.

     RASGELE MUTAGENEZ İLE GENETİK ÇEŞİTLİLİK OLUŞTURMA METODLARI

 1) Kimyasal  Mutagenez:   Etil MetanSulfonat(EMS), Nitröz asit(HNO2)  gibi mutajenik ajanların kullanılması ile DNA dizisinde birtakım mutasyonların gerçekleştirilmesi yöntemidir.  Spesifik bazı kimyasalların kullanılması ile spesifik mutasyonlar elde etmek mümkündür. Örneğin , EMS ile sadece G bazının yanlış kodlanması sağlanabilirken, nitröz asit ile A/T den G/C e ya da tam tersi bir mutasyon elde edilebilir. Ayrıca EMS gibi bazı kimyasallar hem in vivo ve hem de in vitro uygulamalara olanak tanımaktadır.

   Basit uygulama ve ekonomik  nedenler yöntemin avantajı olarak görülmekle birlikte , mutasyon derecesinin kontrol edilememesi ve sınırlı düzeyde a.a  sübstitisyonuna olanak sağlaması en önemli dezavantajı olarak görülebilir.

                                          

2) Mutator Strains: rasgele nokta mutasyonlarının oluşturulması amacıyla DNA tamir mekanizmasından yoksun suşların kullanıldığı yöntemdir. Örneğin bir E. Coli varyantı olan Epicurian coli XLI-Red  DNA tamir  yolaklarındaki eksiklikten ötürü normal suşlara göre  5000 kat mutasyon oranına sahiptir.

   İlgili proteini kodlayan geni taşıyan bir plazmid konukçu mutator suşa transforme edilir. Konukçu suşun üremesi ile birlikte mutant genler doğal olarak kendiliğinden oluşur ve izole edilen plazmidlere ekstra bir ligasyon basamağının uygulanmasına gerek duyulmaz. Ayrıca bu yöntem kullanılarak nokta mutasyonları, delesyonlar ve çerçeve kayması şeklinde mutasyonlar elde edilebilir.

   Yöntemin en önemli dezavantajı suşun kendi genomunda birtakım mutasyonları biriktirmesinden ötürü zayıf düşmeye başlamasıdır. Bir diğer dezavantaj ise mutasyon sıklığının kb başına 0.5 gibi düşük bir değerde seyretmesi ve 24 h inkubasyonun zorunlu olmasıdır.

    3) ‘’Error-Prone’’ PCR :  bu yöntemde Taq Polimerazın  hata yapma sıklığının yüksek olmasından ( kb başına  0,08-0,1) yararlanılır. Bazı PCR koşullarının değiştirilmesi ile bu oran daha da yukarı çekilebilir.  Bu koşullar;

       - baz eşleşme spesifikliği düşürmek amacı ile Mn 2+ iyonlarının eklenmesi;

       - dNTP stokiyometrisinin bozulması,

       - uyumsuz baz eşleşmelerini stabilize etmek için Mg2+ konsantrasyonunun artırılması ve

        - zincir sonunda eşleşmemiş baz sentezi için polimeraz konsantrasyonunun artırılması  şeklindedir.

4) Rolling Circle Error-Prone PCR : ilgili proteini kodlayan genin bir plazmide bağlanması ve dairesel DNA nın çoğaltılması ile farklı uzunluklarda lineer DNA parçalarının elde edilmesi yöntemidir.

  6)DNA Shuffling:  Bazı proteinler geniş gen aileleri tarafından kodlanırlar. Bu gen ilişkileri sayesinde farklı genlerin restriksiyon endonukeazlarla kesilip rasgele bir düzen içinde yeniden birleşmeşeri ile yeni ve üstün özelliklere sahip proteinlerin oluşturulması hedeflenir.

Protein Mühendisliği Uygulamaları
    Fersht ve ark. İndole-3-glycerol phosphate synthase(IGPS) ‘den yola çıkarak phosphoribosylanthranylate isomerase(PRAI) elde etmişlerdir. Yönlendirilmiş evrimin bu çarpıcı uygulaması aynı zamanda enzim evriminde ‘conserved scaffold’ hipotezinin de test edilmesini sağlamıştır.

    Reetz ve ark. Pseudomonas  aeruginosa’dan elde edilen bir lipazın 2-metildekanoata enantio seçiciliğini yönlendirilmiş evrim tekniğini kullanarak artırmayı başarmışlardır. Mutant kütüphanesinin taranmasında  saf(R)- ya da (S)-p-nitrofenil ester kullanmışlardır. Mutant enzimde aktif merkez dışındaki beş a.asidin yer değiştirdiği ve böylece aktif merkez dışındaki loopların flexibilitesinin enantioseçiciliğe katkıda bulunduğu anlaşılmıştır.

    Bir enzimin termal stabilitesindeki artışa aktivite kaybının eşlik edeceği yönündeki yaygın kanıya rağmen, psycrophilic subtilisin proteazının termal stabilitesi 60 C ye çıkarılmış ve 10 C deki aktivitesi de korunmuştur. Bu çalışmada psycrophilic ve mesophilic enzimler arasındaki %30-80 lik amino asit farklılığına karşın mutant enzimin sadece 7 amino asit değişimi içerdiği görülmüştür.(Miyazaki ve ark 2000)

  Maxygen(USA) ve Novo Nordisk(Danimarka) araştırmacıları eşzamanlı olarak  family-shuffled subtilisin kütüphanesinde  dört parametre taramış- 23 C de aktivite, termal stabilite, organik çözgen toleransı ve  pH profili- herbir parametre için  dikkate değer iyileşmeler gözlemlemişlerdir.

    Rasyonel protein dizaynına ilişkin örnekler ise ;

  -alfa amilazın termal stabilitesini artırmak için asparagin artıklarının uzaklaştırılması, rijid karaktere sahip prolin artığının eklenmesi ,

  - Lizozimin termal stabilitesini artrmak için disülfid köprülerinin eklenmesi,

  -3-izopropil malat dehidrogenazın termal stabilitesini artırmak için  hidrofobik çekirdeğin güçlendirilmesi,

  - Format dehidrogenazın oksidasyon stabilitesini artırmak için Met ve Cys artıklarının uzaklaştırılması ise olumlu sonuçlar vermiştir.

    SDM ile rasyonel protein dizaynına güzel bir örnek de tirozin fenol liyaz enziminin SDM ile dikarboksilik amino asit beta liyaz aktivitesi göstermesi örneğidir. Sözkonusu enzim doğada bulunmayan bir enzimdir ve rasyonel protein dizaynı ile yeni enzimlerin üretilmesi yönünde oldukça hoş bir örnek oluşturmaktadır.(Christen P. 1999)

         Rasyonel Dizayn ve Yönlendirilmiş Evrimin Kombinasyonu

  Novo Nordisk araştırmacıları Coprinus cinereus’tan elde ettikleri hem peroksidaz  enzimi üzerinde yürüttükleri bir çalışmada her iki yöntemi kullanmışlar ve epPCR ile 64000 mutant üzerinde yaptıkları tarama çalışması ve moleküler modelleme çalışmaları sonucu kritik amino asidin Glu239 olduğunu tespit etmişler ve saturation mutagenesis ile  Glu239Gly mutantı en iyi sonucu vermiş ve takip eden in vivo shuffling denemesi sonucu elde edilen mutantın termal stabiltesinde 174 katlık artış ve oksidatif stablitesinde ise 100 katlık bir artış elde edilmiştir.(Nat. Biotechnology 1999)

    Her iki yöntemin başarılı kombinasyonuna ilişkin bir diğer örnek ise, Bacillus subtilisten elde edilen 3-izopropil malat dehidrogenaz enzimin termal stabilitesini artırmaya yönelik olarak yapılan çalışmadır. Bu çalışmada SDM ile üçlü mutasyon elde edilmiş ve ardından epPCR kullanılarak termal stabilitenin daha da arttığı ve bu duruma üçlü mutasyona ilaveten epPCR’da ikili bir mutasyonun yol açtğı saptanmıştır. Sonraki iki mutasyon da daha sonra SDM ile kombine edilmiştir. (Oshima T. 1999)

KAYNAKLAR
Protein Mühendisliği,2007, Azmi Telefoncu,Figen Zihnioğlu,İrfan Küfrevioğlu,Ali Kılınç

Nikolas E. Labrou; Current Protein and Peptide Science;2010

Uwe t Bornscheuer; Martina Pohl; Current Opinion in Chemical Biology;2001

M. Hedhammor; T. Gröslund; S. Hober; Chem. Eng. Tech. ; 2005

Karla L. Ewalt; Paul Schimmel; Mc Graw Hill Comp.;2007

        Bu bilgiler Ege Üniversitesi Biyokimya Bölümü mezunu Filiz Taşcı tarafından sitemize gönderilmiştir.Sizlerde yayınlanmasını istediğiniz yazılarınızı biyokimyagentr@gmail.com adresine gönderebilirsiniz.

  

Devamı...