Biyosensörlere Genel Bakış
Biyosensörler; enzim, doku, organel, hücre, mikroorganizma, nükleik asit ve antikor gibi biyolojik materyallerle elektrokimyasal, piezoelektrik, optik ya da termometrik esaslı bir sinyal iletici ve bir kaydedici sistemin entegrasyonu ile oluşturulan biyoanalitik ölçüm sistemleridir.
Biyosensörlerde
biyolojik sistemin yüksek spesifikliği ile fiziksel analiz sisteminin tayin
duyarlılığı bileştirilmiştir. Çok sayıda biyoorganik molekül ve bazı inorganik
moleküllerin analizinde kullanmak amacı ile pek çok biyosensör
geliştirilmiştir. Günümüzde biyosensörler,
özellikle sağlık başta olmak üzere; çevresel analizlerde, askeri sahada, gıda,
farmosötik ve kimya endüstrilerinde kullanılmaktadır (Dinçkaya,
1999).
Biyosensörler
temel olarak; analiz edilecek maddenin biyosensör yüzeyindeki biyokomponentle
etkileşime girmesi sonucu transduser yüzeyinde analit miktarıyla orantılı bir
sinyalin oluşumu ve bu sinyalin ölçüm cihazına iletilmesi ilkesine dayanır.
Biyosensörlerde biyokomponent olarak enzimler,
mikroorganizmalar, bitkisel ve
hayvansal dokular, reseptörler, antikorlar ve nükleik asitler kullanılabilir.
Analiz edilecek moleküle uygun olarak bir biyokomponent ve analitin dönüşümü
sonucunda oluşan elektrokimyasal, optik
ya da gravimetrik sinyali elektriksel sinyale çeviren uygun bir transduser
seçilmelidir. Transduser ve biyokomponent birbirine uygun fiziksel ya da
kimyasal yöntemle bağlanabilir
(Barlett, 1990). Şekil 1.1 ve Şekil
1.2’de bir biyosensör sisteminin birimleri şematik olarak gösterilmiştir. (Newman ve ark. 2001).
İlk biyosensör sistemi L.C. Clark’ın
Cincinnati Hastanesinde (Ohio, ABD) ameliyat sırasında kandaki oksijen
seviyesini O2 duyar amperometrik bir elektrotla ameliyat sırasında
izlemesi ve ardından 1962 yılında O2 duyar amperometrik elektrot
yüzeyine glukoz oksidaz enzimini immobilize ederek hazırladığı glukoz
biyosensörüdür (Lucadou ve ark, 1988). Bu gelişmenin ardından yıllar içinde
pek çok biyosensör geliştirilmiştir. Biyosensör teknolojisi o kadar hızlı
gelişmektedir ki; IUPAC tarafından oluşturulan Biyosensörleri Sınıflandırma ve
Adlandırma Komisyonu 1996 yılında hazırlayıp yayınladığı biyosensör tanımı
biyomikroçiplerin gelişimi ile daha şimdiden geçerliliğini yitirmiştir (Dinçkaya,
1999).
Glukoz + O2 à Glukono-δ-lakton + H2O2
Bir
biyolojik sıvıdaki glukoz ve çözünmüş oksijen elektrot etrafındaki membranı
geçerek elektrot yüzeyine ulaştığında glukoz oksitlenerek glukonik aside
dönüşür ve bu sırada O2 harcanır. Ortamdaki glukoz bittiğinde O2
tüketimi durur. O2 elektrotu ile başlangıçtaki ve reaksiyon
sonundaki çözünmüş O2 ölçülür. Aradaki fark ortamdaki glukozun
oksidasyonu için harcanan O2 olup buradan biyolojik sıvıdaki glukoz
miktarı hesaplanır.
Clark’ın geliştirdiği ilk biyosensör
jenerasyonu membran diyalizatör, reaksiyon bölgesi ve çeviriciden oluşmaktadır.
İkinci jenerasyon biyosensörlerde O2 yerine
elektronları enzimin redoks merkezinden elektrotun yüzeyine taşıyabilen bir
elektron akseptörü (redoks mediyatörü) kullanılmıştır.
GOD
– FADH2 + Mox à GOD – FAD + Mred + 2H2
Mred à
Mox
GOD: Glukoz
oksidaz FAD: Flavin Adenin Dinükleotid M:
Redoks Mediyatörü
Üçüncü
jenerasyon biyosensörlerde enzimin redoks merkezi ile elektrod yüzeyi arasında
direkt elektriksel iletişim sağlanmış ve redoks mediyatörlerine gereksinim
kalmamıştır.
Biyosensörlerin Sınıflandırılması
Analizlenecek madde-biyoaktif bileşen ilişkisine göre biyosensörlerin sınıflandırılması
Biyosensörler farklı bir bakış açısıyla
analizlenecek madde-biyoaktif bileşen ilişkisine göre aşağıdaki şekilde
sınıflandırılabilirler:
a) Biyokatalitik esaslı
biyosensörler (Mikroorganizma ve
enzimlerin kullanıldığı biyosensörler)
b)
Biyoafinite esaslı biyosensörler
(Antikor-antijen ve reseptör-ligand gibi etkileşimlerin kullanıldığı
biyosensörler)
1-Biyoaktif tabaka-iletim ve ölçüm sistemi içeriğine göre biyosensörlerin sınıflandırılması
Biyosensörler ölçüm prensiplerine ve
transduser türüne göre aşağıdaki gibi sınıflandırılabilirler:
a)
Elektrokimyasal esaslı biyosensörler
(Amperometri, Potansiyometri)
b)
Optik esaslı biyosensörler
(Fotometri, Fluorometri, Biyolüminesans)
c) Piezoelektrik esaslı
biyosensörler (Kuartz kristal
mikrobalans, Mikrokantileverlar)
d)
Kalorimetri esaslı biyosensörler
(Termistörler)
2-Biyoaktif tabakada kullanılan biyokomponent türüne göre biyosensörlerin sınıflandırılması
Biyosensörler biyoaktif tabakalarında
görev alan biyokomponentin türüne göre aşağıdaki şekilde sınıflandırılabilirler:
1. Enzim temelli biyosensörler
2. Doku temelli biyosensörler
3. DNA temelli biyosensörler
4. Antikor/Antijen temelli
biyosensörler (İmmünobiyosensörler)
5. Mikrobiyal kökenli biyosensörler
3-Enzim temelli biyosensörler
En
çok kullanılan ve sayıca da en yaygın olan aynı zamanda kullanılabilirliği de
en çok yüksek olan biyosensörler enzim temelli biyosensörlerdir.
Biyosensör geliştirilmesinde transduserle
tek tür enzim eşleştirilebileceği gibi birkaç tür enzimin kombinasyonundan
oluşan multienzim içeren biyosensörler de hazırlanabilir. Bu tamamen analiz
etmek istediğimiz analitin hangi tepkimeler üzerinden sinyal oluşturan türe
dönüştürüldüğüne bağlıdır.
Enzim temelli biyosensörlerin cevap süresi
turnover sayısı yüksek enzimlerin kullanımı ile kısaltılabilir. Ayrıca
kullanılan transduser türüne göre yöntem duyarlılığı da artırılabilir.
4-Doku temelli biyosensörler
Hayvansal
ve bitkisel bazı dokuların ve organellerin kimi enzimlerce zengin olduğu
bilinmektedir. İşte bu enzimlerin izole edilmiş preparatları yerine doğrudan
yoğun bulundukları bu doku parçaları da biyokomponent olarak
kullanılmaktadırlar. Özellikle uzun ve masraflı enzim saflaştırma zorluğundan
kurtardığı için ve hedef analitin çok basamaklı dönüşümünde farklı enzimlerin
bir arada kullanılması yerine bu enzimleri içeren dokunun kullanımı ve
ilgilenilen enzim ticari olarak bulunmuyorsa doku parçalarının biyokomponent
olarak kullanımı avantajlıdır. Dokuların komplekslikleri sebebiyle her yeni tip
elektrot için cevap karakterleri farklı olduğundan her biyosensör için
optimizasyon gereklidir.
Biyosensörlerin
bu türünde enzimler doğal ortamlarında bulunacaklarından katalitik stabilite
açısından çok avantajlıdır. Ancak substratın enzime ulaşması için aşması
gereken difüzyon bariyerinin artmasından dolayı cevap süresi uzar. Bu
dezavantajı kısmen de olsa azaltabilmek için dokular homojenize edilerek
kullanılır. Bunun yanında dokular pek çok enzimi bünyelerinde içerdiklerinden
analitin istenilen enzim dışındaki diğer enzimlerle dönüştürülmesi ile oluşacak
hataları engellemek için diğer enzim sistemlerini inhibe edecek maddeler ve
koşullar biyosensör hazırlanırken kullanılabilir. (Dinçkaya E, 1999, Biyosensörler)
5-DNA temelli biyosensörler
Biyokomponent olarak tek zincirli DNA
oligomerlerinin kullanıldığı biyosensör sistemleridir. DNA yapısının ortaya
çıkması, hibridizasyon, amplifikasyon ve rekombinant DNA teknolojilerinin
gelişimi DNA sensörlerinin geliştirilmesine öncülük etmiştir. Genellikle DNA
sensörleri transduser yüzeyine immobilize haldeki tek zincirli DNA
oligomeri (DNA probu) ile belli bir hastalığı, kalıtsal bir karakteri ya da bir bakteri veya
virüsün patojenitesini simgeleyen bir tek zincirli DNA parçasının hibridizasyonu
prensibine dayanır. Bu hibridizasyonla oluşan çift zincirli DNA sayesinde bir
elektrokimyasal ya da optik sinyal oluşur ve optik, piezoelektrik, elektrokimyasal bir transduser ile sinyal
okunabilir hale getirilir. Kullanılan DNA problları genellikle 20-30 bazlık
kısa tek zincirli DNA’lardır.
Antikor/antijen (immüno sensörler) temelli biyosensörler
Biyokomponent olarak antikorların
kullanıldığı biyosensörler antikor temelli biyosensörler ya da immünosensörler
olarak adlandırılırlar. Vücuda giren yabancı organizmalara (virüs,
bakteri ve protozoa) veya onların
protein ürünlerine karşı bağışıklık sistemi hücreleri tarafından üretilen
protein yapılı maddelere antikor denir. Antikorlar ve antijenler
arasında spesifik etkileşim olduğundan immünosensörler ile son derece spesifik
ve duyarlı analizler yapılabilir. Antikorlar uygun transduserler ile
eşleştirilerek hormon, ilaç, virüs,
bakteri ve çevresel kirletici olan diğer moleküllerin, pestisitlerin, biyomedikal maddelerin tayini için immünosensörler
geliştirilebilir.
6-Mikrobiyal temelli biyosensörler
Bir
mikrobiyal biyosensör, bir transduser ile canlı veya canlı olmayan mikrobiyal
hücrelerin immobilize edilerek birleştirilmesi ile oluşur.
Biyosensörlerin
yapımında kullanılan mikroorganizmalar bir takım avantajlara sahiptir. Mikroorganizmalar;
·
Geniş
bir aralıktaki kimyasal bileşikleri metabolize edebilir.
·
Olumsuz
şartlara uyma konusunda büyük bir kapasiteye sahiptirler ve yeteneklerini
geliştirerek zamanla yeni moleküller oluşturabilirler.
·
Mutasyonla
veya rekombinant DNA teknolojisi ile oluşan genetik modifikasyonlar için
ekonomik intrasellüler enzim kaynağıdır.
Saflaştırılmış
enzimler yüksek spesifik aktiviteleri ve yüksek analitik özellikleriyle
biyosensör yapımında en çok kullanılan materyallerdir. Fakat saflaştırılmış
enzimlerin pahalı olması ve stabil olmaması, onların biyosensör yapımında
kullanılmalarını sınırlandıran özelliklerdir. Enzimlerin %90‘ın üzerinde
intrasellüler oldukları bilinir. Bu bağlamda intrasellüler enzim kaynağı olarak
hücrelerin kullanılması endüstriyel proseslerde saflaştırılmış enzimlere daha
iyi bir alternatiftir (Bickerstaff,
1997; D’Souza, 1999). Bu şekilde,
uzun zaman alan ve pahalı olan enzim saflaştırma prosesleri önlenmiş olur ve
enzimlerin doğal ortamında olmasından dolayı ağır metaller gibi enzim
inaktivasyonuna neden olacak eksternal toksikanlardan korunulmuş olur. Hücreler
aynı zamanda özellikle sıralı enzim katılım prosesleri gerektiren çok amaçlı
kataliz reaksiyonlarının olmasını sağlar.
Hücreler
canlı veya cansız formda kullanılabilir. Canlı hücreler biyosensörlerin
fabrikasyonunda oldukça önem kazanmaktadır (Burlage and Kuo, 1994; Riedel,
1998; Arikawa et al., 1998; Simonian et al.,
1998) . Canlı mikroorganizmalar çeşitli organik bileşikleri aerobik veya
anaerobik olarak metabolize ederek çeşitli transduserlarla izlenebilen amonyak,
karbondioksit, asit vb. son ürünlerin oluşmasını sağlar. Canlı hücreler genel
anlamda mikroorganizmaların substrat özümseme kapasitesinin solunum metabolik
aktivitesi olarak gerçekleştiği durumlarda,
biyolojik oksijen ihtiyacının (BOD)
tahmini veya diğer büyüme veya metabolik olarak vitaminler, şekerler,
organik asitler ve nitrojen bileşikleri gibi nutrientlerin kazanımında
kullanılır (Riedel, 1998). Canlı mikrobiyal biyosensörlerin kullanıldığı bir
başka mekanizma, mikrobiyal solunumun
çevre kirletici unsurlar ile alakalı analitlerle inhibe edilmesidir (Arikawa et
al., 1998).
Enzim
bazlı sensörlerle karşılaştırıldığında hücre kullanmanın ana sınırlandırıcı
faktörlerinden biri, substrat ve ürünlerin hücre zarından difüzyonunun
daha yavaş bir cevap sağlamasıdır (Rainina et al., 1996). Bu problemin
üstesinden gelmenin bir yolu hücre geçirgenliğini arttırmaktır. Hücrelerin
geçirgenliği fiziksel (dondurma-çözme),
kimyasal (organik çözücüler ya da deterjanlar) ve enzimatik (lizozim,
papain) işlemlerle arttırılabilir
(Felix, 1982; D’Souza 1989a; D’Souza, 1999; Patil ve D’Souza, 1997). Bu konuda en çok kullanılan yöntem
toluen, kloroform, etanol ve butanol gibi organik çözücüler ve N-cetyl-N, N,
N-trimetil amonyum bromid (CTAB) , Na-deoksikolat ve dijitonin gibi
deterjanların kullanıldığı kimyasal metodlardır (Patil ve D’Souza, 1997). Bu tür kimyasal işlemler hücre
membranındaki bazı lipidlerin ayrılmasına neden olur ve enzim gibi
makromolekülleri hücre içinde tuttarak küçük molekül ağırlıklı substratların ve
ürünlerin membrandan difüzyonunu kolaylaştırır. Geçirgenlik prosesi hücrelerin
ölümüne neden olsa da intrasellüler enzimlerin ekonomik bir şekilde kullanılmasını
sağlar. Bu metod kofaktör rejenerasyonu veya metabolik solunum gerektirmeyen
basit biyosensör yapımlarında kullanılır (Mlchandani ve Rogers, 1998; Svitel et al., 1998; D’Souza, 1999,
2001).
Mayalardaki invertaz ve katalaz (D’Souza ve Nadkarni, 1980; Svitel et
al., 1998) ile bakterilerdeki üreaz ve fosfataz (Kamath
ve D’Souza, 1992; Macaskie et al., 1992)
gibi periplazmik enzimler dışında hücreler geçirgenlik işlemi olmadan da
kullanılabilir. Son yıllardaki gelişmeler, hücredeki intrasellüler enzimlerin
ve çapaların periplazmik boşluğa transportunu sağlamaktadır. Buna benzer bir
yaklaşım hücre yüzeyinde eksprese edilen organofosfoporus hidrolaz enzimini
içeren rekombinant Escherichia coli hücrelerinin elde edilmesiyle
organofosfat bileşiklerinin tayinlerinde
kullanılan biyosensör yapımıdır (Mulchandani et al., 1998 a, b).
Saf
enzimlerle karşılaştırıldığında hücre bazlı biyosensörlerin düşük spesifik
aktiviteleri hücre kullanımını sınırlandıran bir diğer faktördür. Bu genel
olarak hücredeki diğer enzimlerce katalizlenen, istenmeyen yan reaksiyonların
meydana gelmesine neden olur. Non-spesifik reaksiyonları minimize etmek için
birtakım yaklaşımlar araştırılmaktadır. Hücre geçirgenliğinin arttırılması
istenmeyen yan reaksiyonlara neden olan küçük molekül ağırlıklı kofaktörler
salınımını sağlar (D’Souza, 1989a).
Bunun sonucunda örneğin; laktozu etanol ve CO2’ye dönüştüren
intrasellüler β-galaktozidaz enzimini
içeren maya hücresi geçirgenlik işlemine tabi tutulduğunda, birçok kofaktörü
kaybettiğinden laktozu ancak glukoz ve galaktoza dönüştürebilir (Rao et al., 1988; Joshi et al., 1989). Cansız hücrelerde hücre içindeki diğer
enzimlerce gerçekleşen yan reaksiyonlar, o enzimin fiziksel (ısıtmayla) ya da
kimyasal olarak inaktive edilmesiyle de minimize edilebilir (Godbole et
al., 1983; Di Paolantonio ve
Rechnitz, 1983; D’Souza, 1989a; Riedel, 1998).
Bu konuya ait bilgiler Ege Üniversitesi Biyokimya Mezunu Bürge Ataözü'nün Lisans Tezinden alınmıştır. Kendisine bu bilgileri bizimle paylaştığı için teşekkür ederiz.
0 yorum:
Yorum Gönder