Protein Mühendisliği Uygulamaları

Bir protein mühendisliği uygulamasında amaç;

1.     •Yüksek öneme sahip kimyasalların üretimini katalizleyecek  üstün özelliklere sahip enzimlerin üretimi;

2.     •Yüksek miktarda enzim üretimi

•Üstün özelliklere sahip biyolojik bileşiklerin( sentetik peptidler, sentetik ilaçlar  v.s) üretilmesi   şeklinde olabilmektedir.

•       
Bir proteinde ne gibi özelliklerin değiştirilmesi amaçlanabilir?

Vmax değerinin artırılması

•        Km değerinin düşürülmesi      

•        Bir inhibisyon merkezinin eliminasyonu

•        pH optimumun değiştirilmesi

•        Reaksiyon spesifikliğinin değiştirilmesi

•        Kararsızlığa neden olan artıkların eliminasyonu

•        Termal kararlılığın artırılması

•        Organik çözücülerde kararlılığın artırılması

•        Fizikokimyasal özelliklerinde değişmeler

•        Ligand bağlama spesifikliğin modifikasyonu

•        Kimerik ve çok fonksiyonlu proteinler

•        Saflaştırma için etiket eklenmesi

•        Terapötik ajanların etkinliğinin artırılması

   Protein Mühendisliği Yöntemleri

Protein mühendisliği çalışmalarında sıklıkla karşımıza çıkan iki genel yöntem ‘’rasyonel dizayn’’ ve ‘’yönlendirilmiş evrim’’ dir.

Bu iki yöntem dışında proteinlerin kimyasal ve biyolojik modifikasyonlarından da söz edilebilir.

Kimyasal modifikasyon

— Proteinlerin kimyasal modifikasyonu  yan zincirdeki fonksiyonel gruplar, N ve C terminal üzerinden kovalent bağ oluşumu ve peptid bağının parçalanmasıdır.

— Bu bağlamda genel olarak proteinlerin çapraz bağlanması, kovalent immobilizasyonu ve yan grupların spesifik olarak modifikasyonu ya da işaretlenmesi söz konusu olabilir.

-        Bifonksiyonel çapraz bağlayıcılar(formaldehid,glutarladehid gibi) ile çapraz bağlama

-Sefaroz gibi polimer karakterdeki taşıyıcılar ile kovalent immobilizasyon,

-        Arg,  Asp, Glu, His, Lys, Trp, Cys ve Met artıklarının spesifik reaktifler kullanılarak seçimli bir şekilde modifiye edilmesi,

-        Proteinlerin  izlenmesi ve araştırılması amacıyla yan grupların spesifik olarak etiketlenmesi çalışmaları;

                  1) Floresans etiketleme

                  2) Spin etiketleme

                  3) Afinite etiketleme ve

                  4) Fotoafinite etiketleme

       

      Biyolojik modifikasyonlar

insan genomunda 500 protein kinaz, 150 fosfoprotein fosfataz, 500 proteaz, >100 ubikitinleyici ligaz ve >50 deubiktinleyici enzim bulunmakatadır. Yaklaşık olarak 1000 ila 2000 civarında genin posttranslasyonel modifikasyonlarda yer alan enzimleri kodladığı düşünülmektedir.

    Protein yan zincirinin proteolizi, fosforilasyon, metilasyon, asetilasyon, glikozilasyon, prenilasyon gibi modifikasyonlar sonucu  protein çeşitliliği artırılabilmektedir.

Rasyonel Dizayn

    Rasyonel dizayn, protein dizisinde  önceden tasarlanmış bir değişikliğin bölge yönlendirilmiş mutagenez ile gerçekleştirilmesidir.

 

    Rasyonel dizayn çalışmalarında nokta mutasyonu, insertion ve deletion gibi birtakım mutasyonların gerçekleştirilebilmesi için sıklıkla kullanılan yöntem

Overlap Extension PCR.

    Enzimin yapı-fonksiyon ilişkisi ve stabilitesine etki eden faktörler henüz tam olarak aydınlatılabilmiş olmaması ve spesifik bir mutasyonun enzim 3D yapısına ve  karakterine ne şekilde etki edeceğini tahmin etmenin oldukça zor olması yöntemin en önemli dezavantajı olarak kabul edilir.

Yönlendirilmiş Evrim

    Yönlendirilmiş evrim çalışmalarında modifiye protein elde etmek amacıyla rasgele mutagenez( random mutagenesis) teknikleri kullanılır. Bir yönlendirilmiş evrim çalışması genel hatlarıyla şu dört basamaktan oluşur;

  1) Modifiye edilmek istenen proteine ait gen dizisi seçilir ve mutagenez yöntemleri ile dizi çeşitliliği oluşturulur.

  2) mutant DNA dizileri bir taşıyıcıya bağlanır(ligation) ve  konukçu hücreye transformasyonu ardından protein expresyonu induklenir.

  3) istenen kabiliyet ya da özelliklere sahip transformantların seçimi için bir tarama prosedürünün yürütülmesi.

  4) Seçilen dizinin çoğaltılması sonrası, arzu edilirse, mutagenez ve tarama işlemleri birkaç kez tekrarlanarak daha ideal bir sonuç elde edilebilir. Genellikle  altı döngülü bir çalışmada arzu edilen özelliklere sahip bir protein elde edilebilir.

     RASGELE MUTAGENEZ İLE GENETİK ÇEŞİTLİLİK OLUŞTURMA METODLARI

 1) Kimyasal  Mutagenez:   Etil MetanSulfonat(EMS), Nitröz asit(HNO2)  gibi mutajenik ajanların kullanılması ile DNA dizisinde birtakım mutasyonların gerçekleştirilmesi yöntemidir.  Spesifik bazı kimyasalların kullanılması ile spesifik mutasyonlar elde etmek mümkündür. Örneğin , EMS ile sadece G bazının yanlış kodlanması sağlanabilirken, nitröz asit ile A/T den G/C e ya da tam tersi bir mutasyon elde edilebilir. Ayrıca EMS gibi bazı kimyasallar hem in vivo ve hem de in vitro uygulamalara olanak tanımaktadır.

   Basit uygulama ve ekonomik  nedenler yöntemin avantajı olarak görülmekle birlikte , mutasyon derecesinin kontrol edilememesi ve sınırlı düzeyde a.a  sübstitisyonuna olanak sağlaması en önemli dezavantajı olarak görülebilir.

                                          

2) Mutator Strains: rasgele nokta mutasyonlarının oluşturulması amacıyla DNA tamir mekanizmasından yoksun suşların kullanıldığı yöntemdir. Örneğin bir E. Coli varyantı olan Epicurian coli XLI-Red  DNA tamir  yolaklarındaki eksiklikten ötürü normal suşlara göre  5000 kat mutasyon oranına sahiptir.

   İlgili proteini kodlayan geni taşıyan bir plazmid konukçu mutator suşa transforme edilir. Konukçu suşun üremesi ile birlikte mutant genler doğal olarak kendiliğinden oluşur ve izole edilen plazmidlere ekstra bir ligasyon basamağının uygulanmasına gerek duyulmaz. Ayrıca bu yöntem kullanılarak nokta mutasyonları, delesyonlar ve çerçeve kayması şeklinde mutasyonlar elde edilebilir.

   Yöntemin en önemli dezavantajı suşun kendi genomunda birtakım mutasyonları biriktirmesinden ötürü zayıf düşmeye başlamasıdır. Bir diğer dezavantaj ise mutasyon sıklığının kb başına 0.5 gibi düşük bir değerde seyretmesi ve 24 h inkubasyonun zorunlu olmasıdır.

    3) ‘’Error-Prone’’ PCR :  bu yöntemde Taq Polimerazın  hata yapma sıklığının yüksek olmasından ( kb başına  0,08-0,1) yararlanılır. Bazı PCR koşullarının değiştirilmesi ile bu oran daha da yukarı çekilebilir.  Bu koşullar;

       - baz eşleşme spesifikliği düşürmek amacı ile Mn 2+ iyonlarının eklenmesi;

       - dNTP stokiyometrisinin bozulması,

       - uyumsuz baz eşleşmelerini stabilize etmek için Mg2+ konsantrasyonunun artırılması ve

        - zincir sonunda eşleşmemiş baz sentezi için polimeraz konsantrasyonunun artırılması  şeklindedir.

4) Rolling Circle Error-Prone PCR : ilgili proteini kodlayan genin bir plazmide bağlanması ve dairesel DNA nın çoğaltılması ile farklı uzunluklarda lineer DNA parçalarının elde edilmesi yöntemidir.

  6)DNA Shuffling:  Bazı proteinler geniş gen aileleri tarafından kodlanırlar. Bu gen ilişkileri sayesinde farklı genlerin restriksiyon endonukeazlarla kesilip rasgele bir düzen içinde yeniden birleşmeşeri ile yeni ve üstün özelliklere sahip proteinlerin oluşturulması hedeflenir.

Protein Mühendisliği Uygulamaları
    Fersht ve ark. İndole-3-glycerol phosphate synthase(IGPS) ‘den yola çıkarak phosphoribosylanthranylate isomerase(PRAI) elde etmişlerdir. Yönlendirilmiş evrimin bu çarpıcı uygulaması aynı zamanda enzim evriminde ‘conserved scaffold’ hipotezinin de test edilmesini sağlamıştır.

    Reetz ve ark. Pseudomonas  aeruginosa’dan elde edilen bir lipazın 2-metildekanoata enantio seçiciliğini yönlendirilmiş evrim tekniğini kullanarak artırmayı başarmışlardır. Mutant kütüphanesinin taranmasında  saf(R)- ya da (S)-p-nitrofenil ester kullanmışlardır. Mutant enzimde aktif merkez dışındaki beş a.asidin yer değiştirdiği ve böylece aktif merkez dışındaki loopların flexibilitesinin enantioseçiciliğe katkıda bulunduğu anlaşılmıştır.

    Bir enzimin termal stabilitesindeki artışa aktivite kaybının eşlik edeceği yönündeki yaygın kanıya rağmen, psycrophilic subtilisin proteazının termal stabilitesi 60 C ye çıkarılmış ve 10 C deki aktivitesi de korunmuştur. Bu çalışmada psycrophilic ve mesophilic enzimler arasındaki %30-80 lik amino asit farklılığına karşın mutant enzimin sadece 7 amino asit değişimi içerdiği görülmüştür.(Miyazaki ve ark 2000)

  Maxygen(USA) ve Novo Nordisk(Danimarka) araştırmacıları eşzamanlı olarak  family-shuffled subtilisin kütüphanesinde  dört parametre taramış- 23 C de aktivite, termal stabilite, organik çözgen toleransı ve  pH profili- herbir parametre için  dikkate değer iyileşmeler gözlemlemişlerdir.

    Rasyonel protein dizaynına ilişkin örnekler ise ;

  -alfa amilazın termal stabilitesini artırmak için asparagin artıklarının uzaklaştırılması, rijid karaktere sahip prolin artığının eklenmesi ,

  - Lizozimin termal stabilitesini artrmak için disülfid köprülerinin eklenmesi,

  -3-izopropil malat dehidrogenazın termal stabilitesini artırmak için  hidrofobik çekirdeğin güçlendirilmesi,

  - Format dehidrogenazın oksidasyon stabilitesini artırmak için Met ve Cys artıklarının uzaklaştırılması ise olumlu sonuçlar vermiştir.

    SDM ile rasyonel protein dizaynına güzel bir örnek de tirozin fenol liyaz enziminin SDM ile dikarboksilik amino asit beta liyaz aktivitesi göstermesi örneğidir. Sözkonusu enzim doğada bulunmayan bir enzimdir ve rasyonel protein dizaynı ile yeni enzimlerin üretilmesi yönünde oldukça hoş bir örnek oluşturmaktadır.(Christen P. 1999)

         Rasyonel Dizayn ve Yönlendirilmiş Evrimin Kombinasyonu

  Novo Nordisk araştırmacıları Coprinus cinereus’tan elde ettikleri hem peroksidaz  enzimi üzerinde yürüttükleri bir çalışmada her iki yöntemi kullanmışlar ve epPCR ile 64000 mutant üzerinde yaptıkları tarama çalışması ve moleküler modelleme çalışmaları sonucu kritik amino asidin Glu239 olduğunu tespit etmişler ve saturation mutagenesis ile  Glu239Gly mutantı en iyi sonucu vermiş ve takip eden in vivo shuffling denemesi sonucu elde edilen mutantın termal stabiltesinde 174 katlık artış ve oksidatif stablitesinde ise 100 katlık bir artış elde edilmiştir.(Nat. Biotechnology 1999)

    Her iki yöntemin başarılı kombinasyonuna ilişkin bir diğer örnek ise, Bacillus subtilisten elde edilen 3-izopropil malat dehidrogenaz enzimin termal stabilitesini artırmaya yönelik olarak yapılan çalışmadır. Bu çalışmada SDM ile üçlü mutasyon elde edilmiş ve ardından epPCR kullanılarak termal stabilitenin daha da arttığı ve bu duruma üçlü mutasyona ilaveten epPCR’da ikili bir mutasyonun yol açtğı saptanmıştır. Sonraki iki mutasyon da daha sonra SDM ile kombine edilmiştir. (Oshima T. 1999)

KAYNAKLAR
Protein Mühendisliği,2007, Azmi Telefoncu,Figen Zihnioğlu,İrfan Küfrevioğlu,Ali Kılınç

Nikolas E. Labrou; Current Protein and Peptide Science;2010

Uwe t Bornscheuer; Martina Pohl; Current Opinion in Chemical Biology;2001

M. Hedhammor; T. Gröslund; S. Hober; Chem. Eng. Tech. ; 2005

Karla L. Ewalt; Paul Schimmel; Mc Graw Hill Comp.;2007

        Bu bilgiler Ege Üniversitesi Biyokimya Bölümü mezunu Filiz Taşcı tarafından sitemize gönderilmiştir.Sizlerde yayınlanmasını istediğiniz yazılarınızı biyokimyagentr@gmail.com adresine gönderebilirsiniz.