1- pH Değişimi ile Çöktürme
Çözeltinin pH değerini proteinin izoelektrik noktasına (pI) yakın ya da eşit duruma getirmektir. Bu işleme izoelektrik çöktürme denir. İzoelektrik noktada protein yüzeyindeki negatif ve pozitif yükler birbirlerine eşit olacaklardır ve benzer moleküller arasında artık elektrostatik itmeler oluşmayacaktır. Bu moleküller arasında belki elektrostatik çekimler oluşacak ve bu da proteinlerin çökmesi ile sonuçlanacaktır.
İzoelektrik çöktürme genellikle istenen proteinden çok istenmeyen proteinleri çöktürmek için kullanılır, çünkü çöktürme sırasında denatürasyon ve aktivite kaybı meydana gelebilir. Bunun nedeni ise elektrostatik çekimler nedeni ile proteinin üç boyutlu yapısının bozulmasıdır.
2- İyonik Şiddeti Düşürerek Çöktürme
Bazı proteinler çözeltinin iyonik şiddetinin belirli bir değerin altına düşürülmesi ile çöktürülebilir. Bu nadiren uygulanan bir yöntem, ham ekstratların kullanılma durumlarında gerçekleştirilebilir. İyonik kuvvet sadece su ilavesi ile düşürülebilir. Böylece konsantrasyon azalırken genelde çözünürlük artmış olur. Düşük iyonik şiddet ile çöktürme işleminin gerçekleşmesi izoelektrik noktada ya da izoelektronik nokta civarında daha olasıdır.
3- İyonik Şiddeti Artırarak Çöktürme (Salting-out)
Nötral tuzların ortama giderek artan miktarda eklenmesi ile çöktürme, kullanılan en yaygın yöntemdir. Çöken protein genellikle denatüre olamamaktadır ve aktivitesi de pelletin yeniden çözülmesi ile birlikte ortaya çıkmaktadır. Ek olarak bu tuzlar proteinleri denatürasyona, proteolizize, ya da bakteriyel kontaminasyona karşı stabilize edebilirler. Bu nedenle “salting-out” aşaması, ekstratın bir gece boyunca saklanması için en uygun aşamadır. Burada çökmenin sebebi izoelektrik çökmenin sebebinden farklıdır ve bu nedenle bu iki yöntem aşamalı saflaştırmalar için sıra ile uygulanır. Salting-out protein yüzeyinin hidrofobik yapısına bağlıdır. Suyu sevmeyen gruplar genellikle proteinin iç kısmında bulunurlar ancak bazıları parçalar halinde protein yüzeyinde yer alırlar. Su molekülleri bu gruplar ile temasa zorlanır ve bunu gerçekleştirirken düzenli hale gelir. Sisteme tuzlar eklendiğinde su, tuz iyonlarını çözer ve tuz derişimi arttıkça su proteininin çevresinden ayrılarak hidrofobik parçaları açıkta bırakır. Bir protein üzerindeki bu hidrofobik parçalar diğer bir protein üzerindeki hidrofobik parçalar ile etkileşebilir ki bu da yığışım olayıyla sonuçlanır. Bu nedenle daha büyük ya da daha fazla hidrofobik bölgeler bulunduran proteinlere göre daha önce agrege olacak ve çökeceklerdir. Oluşan agregatlar genellikle birkaç proteinin karışımıdır. İzoelektrik çöktürmede olduğu gibi ekstratın yapısı ilgilenilen proteinin çökmesi için gerekli olan tuz konsantrasyonunu etkileyecektir. İzoelektrik çöktürmede olanın aksine, sıcaklığın yükseltilmesi, çökmenin miktarını arttırmaktadır. Ancak ” salting-out” genellikle aktivite kaybını azaltmak için 4 ° C ‘de gerçekleşir. Tuz olarak genellikle amonyum sülfat kullanılır.
Tuzun etkinliği genel olarak anyonun türüne bağlı olarak belirlenmektedir. Yükü fazla olan anyonlar en etkili olanlardır. Eski sıralanışı fosfat>sülfat>asetat>klorür şeklindedir. Fosfat sülfattan daha etkili olduğu halde pratikte nötral pH’ta fosfat genel olarak en etkili hali olan PO4-3 den daha çok HPO4-2 ve H2PO4- iyonları olarak bulunduğundan amonyum sülfat daha çok tercih edilmektedir. Tek değerlikli katyonlar en etkili katyonlardır. Etki sıralanışı NH4+>K+>Na+ şeklindedir. Tuzun az miktarda safsızlık içermesi kullanımda önemli hata oluşturmaz, ve miktarda fazla kullanıldığında fiyatı ucuz olmalıdır. Birkaç molarlık konsantrasyonlar gerektiğinden tuzun çözünürlüğü de önemlidir. Bu nedenle birçok potasyum tuzu uygun görülmemektedir. Olası denatürasyon riski ya da çözünürlükte değişmeler sebebiyle, tuzun çözünmesi esnasında sıcaklık yükselmesi az olmalıdır. Son olarak, oluşan son çözeltinin yoğunluğu önem taşımaktadır. Çünkü agregat ve çözelti arasındaki yoğunluk farkı santrifüj ile ayırmada önemlidir.
4- Organik Çözücüler ile Çöktürme
Pek çok protein, aseton veya etanol gibi su ile karışabilen organik çözücülerin eklenmesi yoluyla çöktürülebilir. Burada proteinin çökme davranışı geliştiren faktörler izoelektrik çöktürmedekilere benzerdir ve salting-out etkisi ile çöktürmede olduğundan farklıdır. Bu nedenle,bu yöntem bir saflaştırma prosesinde izoelektrik çöktürmeye alternatif olarak ya da salting-out ile birleştirilerek kullanılabilir. Organik çözücünün ilavesi çözeltinin dialektrik sabitini ve dolayısıyla çözme kuvvetini düşürmektedir. Böylece proteinin çözünürlüğü azaltılmış olur ve elektrostatik çekimler etkisi ile agregasyon meydana gelebilir. Çökme pH değeri proteinin pI değerine yakın olunca daha kolay bir şekilde meydana gelmektedir. Proteinin boyutu da çökme davranışını geliştirmektedir.Buna göre daha büyük proteinler diğer özellikleri aynı olan daha küçük proteinlere göre daha düşük organik çözücü konsantrasyonlarında çökeceklerdir. Bununla birlikte bazı hidrofobik proteinler, özellikle hücre membranlarında bulunanlar organik çözücüler etkisi ile çöktürülemezler, ve aslında membranlardan organik çözücü proteinin hidrofobik parçaları etrafındaki su moleküllerinin yerini alacaktır, ki bu da çözünürlüğün artması ile sonuçlanacaktır.
Denatürasyonu minimuma indirmek için organik çözücülerle çöktürme işlemi 0°C’de veya altındaki sıcaklıklarda gerçekleştirilmelidir. Daha yüksek sıcaklıklarda protein konformasyonu hızlı bir şekilde değişecektir. Bu da organik çözücü moleküllerinin proteinin iç kısmına erişmesine olanak sağlayacaktır. Burada bu moleküller hidrofobik etkileşimleri bozabilir ve denatürasyona sebep olabilirler. Organik çözücülerin sulu çözeltilerle karışımlarının donma noktasının 0°C’nin altında olması bu çöktürme işleminin uygulanabilirliği açısından şanstır.
Aseton ve etanol en çok kullanılan çözücülerdir; kullanılan diğer çözücüler metanol, propan-1-ol ve propan-2-ol’dür. Özellikle büyük ölçeklerde çalışırken güvenlik dikkate alınmalıdır; buna göre çözücü göreceli olarak toksik olmamalı ve görece olarak yüksek parlama noktasına sahip olmalıdır.
5- Organik Polimerler ile Çöktürme
PEG(polietilen glikol) en çok kullanılan organik polimerdir. Çöktürme mekanizması organik çözücülerle çöktürme mekanizması ile benzerdir. Bununla birlikte daha düşük konsantrasyonlar gerektirmektedir, genellikle %20’den daha düşük. Daha yüksek konsantrasyonlar viskoz çözelti oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Bu da çökeltinin geri kazanılmasını zorlaştırmaktadır. Polimerin molekül ağırlığı 4000’den daha büyük olmalıdır.
6- Denatürasyon ile Çöktürme
Denatürasyon ile çöktürme eğer ilgilenilen protein muamele sonrasında denatüre olmuyorsa, buna karşılık kontamine edici proteinler denatüre oluyorsa, bir saflaştırma adımı olarak kullanılabilir. Denatürasyon, sıcaklığın, pH’ın değiştirilmesi ya da organik çözücülerin eklenmesi ile gerçekleştirilebilir. Proteinlerin tersiyer yapısı denatürasyon esnasında bozulur. Bunun sonucunda rastgele sarmal yapılar oluşur. Çözelti içerisinde bu sarmallar birbirlerine dolaşırlar ve böylece agregatlar oluştururlar. Agregat oluşumu pH ve iyonik şiddet ile geliştirilebilir. Daha çok düşük iyonik şiddette ve proteinin izoelektrik noktası civarlarında gerçekleşir.
Yüksek sıcaklık ile denatürasyon: Yüksek sıcaklıklar, proteindeki konformasyonu sağlayan bağları kırarak ve birleşmiş çözücü moleküllerinin serbest kalmasını sağlayarak gerçekleştirmektedir. Farklı proteinler için denatürasyon sıcaklığı da farklıdır.
pH ile denatürasyon: Aşırı pH iç kısımlarda elektrostatik itmeye neden olmaktadır ya da amino asit yan zincirindeki yükleri değiştirerek iç kısımlardaki elektrostatik çekme kuvvetlerini yok etmektedir. Bunun sonucunda protein açılır. Ve bağlanmış çözücü molekülleri uzaklaşır. Bu da denatürasyon ile sonuçlanır.
Organik çözücü ile denatürasyon: Organik çözücüler ile seçici denatürasyon, denatürasyonu arttırmak için, genellikle 20-30 °C’lerde gerçekleştirilir.
proteinlerin çöktürme özellikleri proteinleri çöktürme deneyleri,protein saflaştırılması.sütten ve etten protein eldesi protein çöktürme yöntemleri salting out tuz ile protein çöktürme
0 yorum:
Yorum Gönder