DNA İzolasyonu nasıl yapılır

 Temelde 3 aşamadan meydana gelir;

—Hücre duvarının parçalanması.

—DNA-Protein kompleksinin çözülmesi.

—DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması.

  Değişik organizmalardaki yapısal farklılıklar çeşitli izolasyon yöntemlerinin kullanılmasını gerektirebilir.

Genin Elde Edilmesi

A. İstenilen genin yer aldığı kromozom uygun Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri ile parçalanır.

— Bu enzimler DNA’yı 6-8 taban çiftinden oluşan ve “palindrom” adı verilen özgül bölgelerden keser.

—Palindrom; DNA ipliğinin 3’ ucundan itibaren okunduğunda aynı nükleotidlerin yer aldığı DNA dizileridir.

—Enzimler DNA üzerinde 2 türlü kesi yapar. Biri yapışkan uçlar oluşturan, diğeri palindromların tam ortasından yapılan ve kör ya da küt(blunt) uçlar oluşturan kesilerdir.

B. İstenilen genler orijinal kromozomdan mekanik yol ile edilebilir.

C. Sentetik olarak elde edilebilir.

D. İstenilen gene ait mRNA’dan reverse transkriptaz enzimi yardımı ile cDNA (komplementer DNA) elde edilebilir.

DNA Parçalarının Vektörler İle Birleştirilmesi;

—Vektörler, kendilerine takılan DNA parçasını nakleden ve replike eden taşıyıcı DNA molekülleridir.

—Bir DNA molekülünün vektör olarak kullanılabilmesi için birtakım özelliklere sahip olması gerekir;

a.Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir.

b.Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir.

c.Vektörde seçicilik sağlayan “marker genler” bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir.

d.Vektör ve vektörün taşıdığı DNA parçası konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir.— Konak özgüllüğü,

—Taşıdıkları parçanın büyüklüğü,

—Kopya sayıları,

—Tanıma dizilerinin sayıları,

—Marker genlerinin tipi ve sayıları

—

    gibi özellikleri açısından birçok farklı klonlama vektörü vardır.

Başlıca Vektörler;

—Plasmidler

—Bakteriyofajlar

—Cosmidler

—Bakteri Yapay Kromozomları (BAC)

—Maya Yapay Kromozomları (YAC)

—Memeli Yapay Kromozomları (MAC)

—İnsan Yapay Kromozomları (HAC)

—İfade Vektörleri

  Virüsler canlı hücrelere girebilirler ve çoğalabilirler. Bir kromozomal gen, viral genom içerisine sokulursa, gen virüs DNA’sı ile birlikte replikasyona uğrar ve çoğalır. Lambda fajının genlerinin hepsi tanımlanmış, tüm genomunun haritası çıkarılmış ve nükleotit dizisi belirlenmiştir. ʎ fajının genetik olarak değiştirilmiş suşları vektör olarak kullanılır.

Devamı...

Protein Mühendisliği Uygulamaları

    Fersht ve ark. İndole-3-glycerol phosphate synthase(IGPS) ‘den yola çıkarak phosphoribosylanthranylate isomerase(PRAI) elde etmişlerdir. Yönlendirilmiş evrimin bu çarpıcı uygulaması aynı zamanda enzim evriminde ‘conserved scaffold’ hipotezinin de test edilmesini sağlamıştır.

    Reetz ve ark. Pseudomonas  aeruginosa’dan elde edilen bir lipazın 2-metildekanoata enantio seçiciliğini yönlendirilmiş evrim tekniğini kullanarak artırmayı başarmışlardır. Mutant kütüphanesinin taranmasında  saf(R)- ya da (S)-p-nitrofenil ester kullanmışlardır. Mutant enzimde aktif merkez dışındaki beş a.asidin yer değiştirdiği ve böylece aktif merkez dışındaki loopların flexibilitesinin enantioseçiciliğe katkıda bulunduğu anlaşılmıştır.     Bir enzimin termal stabilitesindeki artışa aktivite kaybının eşlik edeceği yönündeki yaygın kanıya rağmen, psycrophilic subtilisin proteazının termal stabilitesi 60 C ye çıkarılmış ve 10 C deki aktivitesi de korunmuştur. Bu çalışmada psycrophilic ve mesophilic enzimler arasındaki %30-80 lik amino asit farklılığına karşın mutant enzimin sadece 7 amino asit değişimi içerdiği görülmüştür.(Miyazaki ve ark 2000)  Maxygen(USA) ve Novo Nordisk(Danimarka) araştırmacıları eşzamanlı olarak  family-shuffled subtilisin kütüphanesinde  dört parametre taramış- 23 C de aktivite, termal stabilite, organik çözgen toleransı ve  pH profili- herbir parametre için  dikkate değer iyileşmeler gözlemlemişlerdir.    Rasyonel protein dizaynına ilişkin örnekler ise ;

  -alfa amilazın termal stabilitesini artırmak için asparagin artıklarının uzaklaştırılması, rijid karaktere sahip prolin artığının eklenmesi ,

  - Lizozimin termal stabilitesini artrmak için disülfid köprülerinin eklenmesi,

  -3-izopropil malat dehidrogenazın termal stabilitesini artırmak için  hidrofobik çekirdeğin güçlendirilmesi,

  - Format dehidrogenazın oksidasyon stabilitesini artırmak için Met ve Cys artıklarının uzaklaştırılması ise olumlu sonuçlar vermiştir.

Devamı...

HEMATOPOETİK KÖK HÜCE KAYNAKLARI NELERDİR ?

Kemik İliği: Kök hücrelerin klasik kaynağı kemik iliğidir. 40 yıldır doktorlar kemik iliğinden, donorden anestezi altında genelde kalça kemiğinden iğne yardımı ile kemik iliği hücreleri elde etmektedirler. Bu hücrelerin her 100.000 de biri uzun vadede kan elemanlarını oluşturan kök hücrelerdir, diğerleri stromal hücreler, stromal kök hücreler, kan progenitor hücreleri, ve matür beyaz ve kırmızı hücrelerdir.

Periferik Kan: Son zamanlarda hekimler klinik transplantasyon için kök hücreleri dolaşımdaki kandan elde etmeyi tercih ediyorlar. Yıllardır dolaşımdaki kök hücre ve öncü hücre sayısı az olarak bilinirdi, fakat son 10 yılda bilim adamları kök hücrelerin kemik iliğinden dolaşıma geçmesini sağlayan granülasit stimule edici faktör gibi sitokinler yardımı ile bu sayıyı arttırdılar.Bu işlem için donöre kök hücreler elde edilmeden birkaç gün önce GCSF enjekte edilir. Hücreleri toplamak için donörün venine bir tüp takılır,kan CD34+ hücrelerini çeken bir bir filtrenin içinden geçirilir ve kırmızı hücreler tekrar hastaya verilir.

Umblikal Kord Kanı: 1980’lerin sonu ve 1990’ların başında bilim adamları insan umblikal kordon kanı ve plasentanın hemotopoetik kök hücreler açısından zengin bir kaynak olduğunu fark ettiler. Bu doku (plasenta) gebelik boyunca gelişmekte olan fetusu besler, bebekle birlikte doğar ve çöpe atılır idi. Fankoni anemili bir çocuğa yapılan başarılı bir kordon kanı transplantasyonundan sonra bu hücrelerin toplanması ve tedavide kullanımı arttı. Bugün kordon kanının çoğaltılması ve kemik iliği kök hücreleri ile arasındaki farklar ve kıyaslamalarla ilgili pek çok çalışma yürütülmektedir.Bugün kordon kanı kök hücrelerinin multiple germ tabakası hücrelerine (multipotent), hatta endoderm, ekdoderm, ve mesoderm gibi tüm germ tabakası hücrelerine (pluripotent) dönüşebileceği iddia edilmektedir.

Devamı...

Deri check-up'ı DNA'yı inceliyor

Cilt sağlığını belirleyen en önemli etkenlerden bir tanesi cilt hücreleri içindeki DNA'lardır. Deri hem en büyük organımız olması nedeniyle hem de dışarıyla en fazla temasta olan organ olmasından dolayı bakıma en muhtaç bölümdür.

Plastik cerrah Dr. Dilek Avşar, cilt sağlığı ve yıpranmaların önüne erken geçebilmek için deri check up'ı denilen yöntemin uygulanabileceğini belirtiyor. Bu çalışmada DNA'da estetik açıdan etkili olan parametreler inceleniyor.

İLK OLARAK ELASTİKİYET AZALIYOR

Cilt yaşlanmaya başladığında sıkılığı ve elastikiyeti azalır ve ciltte sarkmalar başlar. İlk kategoride elastikiyeti ve sıkılığı sağlayan kollejen üreten genler incelenir.Kollejen yapımının azalması ve kollejenlerin yaşlanması elastikeyet kaybı ve sarkmayla sonuçlanır.Genetik yapı kollejen üretiminde ve kollejenin dayanıklılığında önmelidir.Bu kategorideki inceleme ile ciltteki erken kırışıklığın,sarkmanın önlemleri alınabilir. 

CİLTTE ÇATLAMA GEVŞEKLİĞE BAKILIYOR

İkinci katogoride ise glikasyon durumu incelenir. Glikasyon, vucutta işlenmeden kalmış kalan fazla şekerin elastin ve kollejene bağlanmasıdır ki bu tüm vucudu yaşlılığa götüren en büyük etkendir. Ciltte oluşan glikasyonla ciltte çatlama, incelme, kendini onaramama, gevşeklik ve kızarıklık görülür.

GÜNEŞİN ZARARLI ETKİLERİ

Üçüncü kategoride güneşin zararlı etkileri ve pigmentasyon genleri incelenir. Yaşlanma ve lekenme durumu için önemli olan genler incelenerek bu yönde tedbir alınması sağlanır. Dördüncü kategori de ise vücutta hastalık yapan serbest radikallerin deriye ait genleri incelenerek; genetik olarak serbest radikallerle vucutta savaşan antioksidanların kabiliyetleri tespit edilir.Serbest radikaller;erken yaşlanma,deride mat görünüm,lekelenme ve sarkmalar yapar. Antioksidanlarda onları engllemeye yönelik çalışır.

HASSASİYET VE İLTİHAP YAPAN GENLER

Beşinci kategori ise deride hassasiyet ve inflamasyon yapan genler incelenir. Bu sayede ciltte  iyileşmenin geçıkmesi,kızarıklık ve şişkinlik(ödem) gibi cildi yıpratıcı sorunlarla karşılaşılabilir. Toplam bu 5 kategorideki genler incelenerek kişinin bu bölümlerde zayıf ve güçlü olduğu yönler ortaya çıkarılır.Yapılacak tedaviler ve alınacak önlemlerle zayıf olan yönler desteklenmiş ve güçlü oldugu kısımlara da gereksiz yatırımlar yapılmamış olur. Doğru ve kişiye özgü yol haritası ile de kişinin cildindeki erken yaşlanma bulguları geciktirilir ve iyi yaş alması sağlanır.

Devamı...

Biyosensörlere Genel Bakış

Biyosensörlere Genel Bakış

Biyosensörler; enzim, doku, organel, hücre, mikroorganizma, nükleik asit ve antikor gibi biyolojik materyallerle elektrokimyasal, piezoelektrik, optik ya da termometrik esaslı bir sinyal iletici ve bir kaydedici sistemin entegrasyonu ile oluşturulan biyoanalitik ölçüm sistemleridir.

 Biyosensörlerde biyolojik sistemin yüksek spesifikliği ile fiziksel analiz sisteminin tayin duyarlılığı bileştirilmiştir. Çok sayıda biyoorganik molekül ve bazı inorganik moleküllerin analizinde kullanmak amacı ile pek çok biyosensör geliştirilmiştir. Günümüzde biyosensörler,  özellikle sağlık başta olmak üzere; çevresel analizlerde,  askeri sahada,  gıda,  farmosötik ve kimya endüstrilerinde kullanılmaktadır  (Dinçkaya,  1999).

Biyosensörler temel olarak; analiz edilecek maddenin biyosensör yüzeyindeki biyokomponentle etkileşime girmesi sonucu transduser yüzeyinde analit miktarıyla orantılı bir sinyalin oluşumu ve bu sinyalin ölçüm cihazına iletilmesi ilkesine dayanır. Biyosensörlerde biyokomponent olarak enzimler,  mikroorganizmalar,  bitkisel ve hayvansal dokular,  reseptörler,  antikorlar ve nükleik asitler kullanılabilir. Analiz edilecek moleküle uygun olarak bir biyokomponent ve analitin dönüşümü sonucunda oluşan elektrokimyasal,  optik ya da gravimetrik sinyali elektriksel sinyale çeviren uygun bir transduser seçilmelidir. Transduser ve biyokomponent birbirine uygun fiziksel ya da kimyasal yöntemle bağlanabilir  (Barlett,  1990). Şekil 1.1 ve Şekil 1.2’de bir biyosensör sisteminin birimleri şematik olarak gösterilmiştir.  (Newman ve ark.  2001). 

İlk biyosensör sistemi L.C. Clark’ın Cincinnati Hastanesinde (Ohio, ABD) ameliyat sırasında kandaki oksijen seviyesini O₂ duyar amperometrik bir elektrotla ameliyat sırasında izlemesi ve ardından 1962 yılında O₂ duyar amperometrik elektrot yüzeyine glukoz oksidaz enzimini immobilize ederek hazırladığı glukoz biyosensörüdür  (Lucadou ve ark,  1988). Bu gelişmenin ardından yıllar içinde pek çok biyosensör geliştirilmiştir. Biyosensör teknolojisi o kadar hızlı gelişmektedir ki; IUPAC tarafından oluşturulan Biyosensörleri Sınıflandırma ve Adlandırma Komisyonu 1996 yılında hazırlayıp yayınladığı biyosensör tanımı biyomikroçiplerin gelişimi ile daha şimdiden geçerliliğini yitirmiştir  (Dinçkaya,  1999).

Glukoz + O₂   à    Glukono-δ-lakton + H₂O₂

Bir biyolojik sıvıdaki glukoz ve çözünmüş oksijen elektrot etrafındaki membranı geçerek elektrot yüzeyine ulaştığında glukoz oksitlenerek glukonik aside dönüşür ve bu sırada O₂ harcanır. Ortamdaki glukoz bittiğinde O₂ tüketimi durur. O₂ elektrotu ile başlangıçtaki ve reaksiyon sonundaki çözünmüş O₂ ölçülür. Aradaki fark ortamdaki glukozun oksidasyonu için harcanan O₂ olup buradan biyolojik sıvıdaki glukoz miktarı hesaplanır.

Clark’ın geliştirdiği ilk biyosensör jenerasyonu membran diyalizatör, reaksiyon bölgesi ve çeviriciden oluşmaktadır.

İkinci jenerasyon biyosensörlerde O₂ yerine elektronları enzimin redoks merkezinden elektrotun yüzeyine taşıyabilen bir elektron akseptörü (redoks mediyatörü) kullanılmıştır.

GOD – FADH₂ +  M_ox    à   GOD – FAD + M_red + 2H₂

                                                 M_red  à   M_ox

GOD: Glukoz oksidaz   FAD: Flavin Adenin Dinükleotid   M: Redoks Mediyatörü

Üçüncü jenerasyon biyosensörlerde enzimin redoks merkezi ile elektrod yüzeyi arasında direkt elektriksel iletişim sağlanmış ve redoks mediyatörlerine gereksinim kalmamıştır.

Biyosensörlerin Sınıflandırılması

Analizlenecek madde-biyoaktif bileşen ilişkisine göre biyosensörlerin sınıflandırılması

Biyosensörler farklı bir bakış açısıyla analizlenecek madde-biyoaktif bileşen ilişkisine göre aşağıdaki şekilde sınıflandırılabilirler:

a) Biyokatalitik esaslı biyosensörler  (Mikroorganizma ve enzimlerin kullanıldığı biyosensörler)

b)  Biyoafinite esaslı biyosensörler  (Antikor-antijen ve reseptör-ligand gibi etkileşimlerin kullanıldığı biyosensörler)

 1-Biyoaktif tabaka-iletim ve ölçüm sistemi içeriğine göre biyosensörlerin sınıflandırılması

Biyosensörler ölçüm prensiplerine ve transduser türüne göre aşağıdaki gibi sınıflandırılabilirler:

a)  Elektrokimyasal esaslı biyosensörler  (Amperometri,  Potansiyometri)

b)  Optik esaslı biyosensörler  (Fotometri,  Fluorometri,  Biyolüminesans)

c) Piezoelektrik esaslı biyosensörler  (Kuartz kristal mikrobalans,  Mikrokantileverlar)

d)  Kalorimetri esaslı biyosensörler  (Termistörler) 

2-Biyoaktif tabakada kullanılan biyokomponent türüne göre biyosensörlerin sınıflandırılması

Biyosensörler biyoaktif tabakalarında görev alan biyokomponentin türüne göre aşağıdaki şekilde sınıflandırılabilirler:

1. Enzim temelli biyosensörler

2. Doku temelli biyosensörler

3. DNA temelli biyosensörler

4. Antikor/Antijen temelli biyosensörler  (İmmünobiyosensörler)

5. Mikrobiyal kökenli biyosensörler

3-Enzim temelli biyosensörler

     En çok kullanılan ve sayıca da en yaygın olan aynı zamanda kullanılabilirliği de en çok yüksek olan biyosensörler enzim temelli biyosensörlerdir.

     Biyosensör geliştirilmesinde transduserle tek tür enzim eşleştirilebileceği gibi birkaç tür enzimin kombinasyonundan oluşan multienzim içeren biyosensörler de hazırlanabilir. Bu tamamen analiz etmek istediğimiz analitin hangi tepkimeler üzerinden sinyal oluşturan türe dönüştürüldüğüne bağlıdır.

     Enzim temelli biyosensörlerin cevap süresi turnover sayısı yüksek enzimlerin kullanımı ile kısaltılabilir. Ayrıca kullanılan transduser türüne göre yöntem duyarlılığı da artırılabilir.

4-Doku temelli biyosensörler

Hayvansal ve bitkisel bazı dokuların ve organellerin kimi enzimlerce zengin olduğu bilinmektedir. İşte bu enzimlerin izole edilmiş preparatları yerine doğrudan yoğun bulundukları bu doku parçaları da biyokomponent olarak kullanılmaktadırlar. Özellikle uzun ve masraflı enzim saflaştırma zorluğundan kurtardığı için ve hedef analitin çok basamaklı dönüşümünde farklı enzimlerin bir arada kullanılması yerine bu enzimleri içeren dokunun kullanımı ve ilgilenilen enzim ticari olarak bulunmuyorsa doku parçalarının biyokomponent olarak kullanımı avantajlıdır. Dokuların komplekslikleri sebebiyle her yeni tip elektrot için cevap karakterleri farklı olduğundan her biyosensör için optimizasyon gereklidir.

Biyosensörlerin bu türünde enzimler doğal ortamlarında bulunacaklarından katalitik stabilite açısından çok avantajlıdır. Ancak substratın enzime ulaşması için aşması gereken difüzyon bariyerinin artmasından dolayı cevap süresi uzar. Bu dezavantajı kısmen de olsa azaltabilmek için dokular homojenize edilerek kullanılır. Bunun yanında dokular pek çok enzimi bünyelerinde içerdiklerinden analitin istenilen enzim dışındaki diğer enzimlerle dönüştürülmesi ile oluşacak hataları engellemek için diğer enzim sistemlerini inhibe edecek maddeler ve koşullar biyosensör hazırlanırken kullanılabilir. (Dinçkaya E, 1999,  Biyosensörler)

5-DNA temelli biyosensörler

Biyokomponent olarak tek zincirli DNA oligomerlerinin kullanıldığı biyosensör sistemleridir. DNA yapısının ortaya çıkması,  hibridizasyon,  amplifikasyon ve rekombinant DNA teknolojilerinin gelişimi DNA sensörlerinin geliştirilmesine öncülük etmiştir. Genellikle DNA sensörleri transduser yüzeyine immobilize haldeki tek zincirli DNA oligomeri  (DNA probu)  ile belli bir hastalığı,  kalıtsal bir karakteri ya da bir bakteri veya virüsün patojenitesini simgeleyen bir tek zincirli DNA parçasının hibridizasyonu prensibine dayanır. Bu hibridizasyonla oluşan çift zincirli DNA sayesinde bir elektrokimyasal ya da optik sinyal oluşur ve optik,  piezoelektrik,  elektrokimyasal bir transduser ile sinyal okunabilir hale getirilir. Kullanılan DNA problları genellikle 20-30 bazlık kısa tek zincirli DNA’lardır.

Antikor/antijen (immüno sensörler) temelli biyosensörler

Biyokomponent olarak antikorların kullanıldığı biyosensörler antikor temelli biyosensörler ya da immünosensörler olarak adlandırılırlar. Vücuda giren yabancı organizmalara  (virüs,  bakteri ve protozoa)  veya onların protein ürünlerine karşı bağışıklık sistemi hücreleri tarafından üretilen protein yapılı maddelere antikor denir. Antikorlar ve antijenler arasında spesifik etkileşim olduğundan immünosensörler ile son derece spesifik ve duyarlı analizler yapılabilir. Antikorlar uygun transduserler ile eşleştirilerek hormon,  ilaç,  virüs,  bakteri ve çevresel kirletici olan diğer moleküllerin,  pestisitlerin,  biyomedikal maddelerin tayini için immünosensörler geliştirilebilir.

6-Mikrobiyal temelli biyosensörler

Bir mikrobiyal biyosensör, bir transduser ile canlı veya canlı olmayan mikrobiyal hücrelerin immobilize edilerek birleştirilmesi ile oluşur.     

Biyosensörlerin yapımında kullanılan mikroorganizmalar bir takım avantajlara sahiptir. Mikroorganizmalar;

·                Geniş bir aralıktaki kimyasal bileşikleri metabolize edebilir.

·                Olumsuz şartlara uyma konusunda büyük bir kapasiteye sahiptirler ve yeteneklerini geliştirerek zamanla yeni moleküller oluşturabilirler. 

·                Mutasyonla veya rekombinant DNA teknolojisi ile oluşan genetik modifikasyonlar için ekonomik intrasellüler enzim kaynağıdır.

Saflaştırılmış enzimler yüksek spesifik aktiviteleri ve yüksek analitik özellikleriyle biyosensör yapımında en çok kullanılan materyallerdir. Fakat saflaştırılmış enzimlerin pahalı olması ve stabil olmaması, onların biyosensör yapımında kullanılmalarını sınırlandıran özelliklerdir. Enzimlerin %90‘ın üzerinde intrasellüler oldukları bilinir. Bu bağlamda intrasellüler enzim kaynağı olarak hücrelerin kullanılması endüstriyel proseslerde saflaştırılmış enzimlere daha iyi bir alternatiftir (Bickerstaff,  1997; D’Souza,  1999). Bu şekilde, uzun zaman alan ve pahalı olan enzim saflaştırma prosesleri önlenmiş olur ve enzimlerin doğal ortamında olmasından dolayı ağır metaller gibi enzim inaktivasyonuna neden olacak eksternal toksikanlardan korunulmuş olur. Hücreler aynı zamanda özellikle sıralı enzim katılım prosesleri gerektiren çok amaçlı kataliz reaksiyonlarının olmasını sağlar.

Hücreler canlı veya cansız formda kullanılabilir. Canlı hücreler biyosensörlerin fabrikasyonunda oldukça önem kazanmaktadır (Burlage and Kuo, 1994; Riedel, 1998; Arikawa et al., 1998; Simonian et al.,  1998) . Canlı mikroorganizmalar çeşitli organik bileşikleri aerobik veya anaerobik olarak metabolize ederek çeşitli transduserlarla izlenebilen amonyak, karbondioksit, asit vb. son ürünlerin oluşmasını sağlar. Canlı hücreler genel anlamda mikroorganizmaların substrat özümseme kapasitesinin solunum metabolik aktivitesi olarak gerçekleştiği durumlarda,  biyolojik oksijen ihtiyacının (BOD)  tahmini veya diğer büyüme veya metabolik olarak vitaminler, şekerler, organik asitler ve nitrojen bileşikleri gibi nutrientlerin kazanımında kullanılır (Riedel, 1998). Canlı mikrobiyal biyosensörlerin kullanıldığı bir başka mekanizma,  mikrobiyal solunumun çevre kirletici unsurlar ile alakalı analitlerle inhibe edilmesidir (Arikawa et al.,  1998).

Enzim bazlı sensörlerle karşılaştırıldığında hücre kullanmanın ana sınırlandırıcı faktörlerinden biri, substrat ve ürünlerin hücre zarından difüzyonunun daha yavaş bir cevap sağlamasıdır (Rainina et al., 1996). Bu problemin üstesinden gelmenin bir yolu hücre geçirgenliğini arttırmaktır. Hücrelerin geçirgenliği fiziksel (dondurma-çözme),  kimyasal (organik çözücüler ya da deterjanlar) ve enzimatik (lizozim, papain) işlemlerle arttırılabilir  (Felix, 1982; D’Souza 1989a; D’Souza,  1999; Patil ve D’Souza,  1997). Bu konuda en çok kullanılan yöntem toluen, kloroform, etanol ve butanol gibi organik çözücüler ve N-cetyl-N, N, N-trimetil amonyum bromid (CTAB) , Na-deoksikolat ve dijitonin gibi deterjanların kullanıldığı kimyasal metodlardır (Patil ve D’Souza,  1997). Bu tür kimyasal işlemler hücre membranındaki bazı lipidlerin ayrılmasına neden olur ve enzim gibi makromolekülleri hücre içinde tuttarak küçük molekül ağırlıklı substratların ve ürünlerin membrandan difüzyonunu kolaylaştırır. Geçirgenlik prosesi hücrelerin ölümüne neden olsa da intrasellüler enzimlerin ekonomik bir şekilde kullanılmasını sağlar. Bu metod kofaktör rejenerasyonu veya metabolik solunum gerektirmeyen basit biyosensör yapımlarında kullanılır (Mlchandani ve Rogers,  1998; Svitel et al., 1998; D’Souza, 1999, 2001).

 Mayalardaki invertaz ve katalaz  (D’Souza ve Nadkarni, 1980; Svitel et al.,  1998)  ile bakterilerdeki üreaz ve fosfataz (Kamath ve D’Souza,  1992; Macaskie et al.,  1992)  gibi periplazmik enzimler dışında hücreler geçirgenlik işlemi olmadan da kullanılabilir. Son yıllardaki gelişmeler, hücredeki intrasellüler enzimlerin ve çapaların periplazmik boşluğa transportunu sağlamaktadır. Buna benzer bir yaklaşım hücre yüzeyinde eksprese edilen organofosfoporus hidrolaz enzimini içeren rekombinant Escherichia coli hücrelerinin elde edilmesiyle organofosfat bileşiklerinin  tayinlerinde kullanılan biyosensör yapımıdır (Mulchandani et al., 1998 a, b).

Saf enzimlerle karşılaştırıldığında hücre bazlı biyosensörlerin düşük spesifik aktiviteleri hücre kullanımını sınırlandıran bir diğer faktördür. Bu genel olarak hücredeki diğer enzimlerce katalizlenen, istenmeyen yan reaksiyonların meydana gelmesine neden olur. Non-spesifik reaksiyonları minimize etmek için birtakım yaklaşımlar araştırılmaktadır. Hücre geçirgenliğinin arttırılması istenmeyen yan reaksiyonlara neden olan küçük molekül ağırlıklı kofaktörler salınımını sağlar (D’Souza,  1989a). Bunun sonucunda örneğin; laktozu etanol ve CO₂’ye dönüştüren intrasellüler  β-galaktozidaz enzimini içeren maya hücresi geçirgenlik işlemine tabi tutulduğunda, birçok kofaktörü kaybettiğinden laktozu  ancak glukoz ve galaktoza dönüştürebilir (Rao et al.,  1988; Joshi et al.,  1989). Cansız hücrelerde hücre içindeki diğer enzimlerce gerçekleşen yan reaksiyonlar, o enzimin fiziksel (ısıtmayla) ya da kimyasal olarak inaktive edilmesiyle de minimize edilebilir (Godbole et al.,  1983; Di Paolantonio ve Rechnitz,  1983; D’Souza,  1989a; Riedel,  1998).

Bu konuya ait bilgiler Ege Üniversitesi Biyokimya Mezunu Bürge Ataözü'nün Lisans Tezinden alınmıştır. Kendisine bu bilgileri bizimle paylaştığı için teşekkür ederiz.

Devamı...