DNA İzolasyonu nasıl yapılır

 Temelde 3 aşamadan meydana gelir;

—Hücre duvarının parçalanması.

—DNA-Protein kompleksinin çözülmesi.

—DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması.

  Değişik organizmalardaki yapısal farklılıklar çeşitli izolasyon yöntemlerinin kullanılmasını gerektirebilir.

Genin Elde Edilmesi

A. İstenilen genin yer aldığı kromozom uygun Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri ile parçalanır.

— Bu enzimler DNA’yı 6-8 taban çiftinden oluşan ve “palindrom” adı verilen özgül bölgelerden keser.

—Palindrom; DNA ipliğinin 3’ ucundan itibaren okunduğunda aynı nükleotidlerin yer aldığı DNA dizileridir.

—Enzimler DNA üzerinde 2 türlü kesi yapar. Biri yapışkan uçlar oluşturan, diğeri palindromların tam ortasından yapılan ve kör ya da küt(blunt) uçlar oluşturan kesilerdir.

B. İstenilen genler orijinal kromozomdan mekanik yol ile edilebilir.

C. Sentetik olarak elde edilebilir.

D. İstenilen gene ait mRNA’dan reverse transkriptaz enzimi yardımı ile cDNA (komplementer DNA) elde edilebilir.

DNA Parçalarının Vektörler İle Birleştirilmesi;

—Vektörler, kendilerine takılan DNA parçasını nakleden ve replike eden taşıyıcı DNA molekülleridir.

—Bir DNA molekülünün vektör olarak kullanılabilmesi için birtakım özelliklere sahip olması gerekir;

a.Kendini ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir.

b.Klonlanacak DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir.

c.Vektörde seçicilik sağlayan “marker genler” bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir.

d.Vektör ve vektörün taşıdığı DNA parçası konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir.— Konak özgüllüğü,

—Taşıdıkları parçanın büyüklüğü,

—Kopya sayıları,

—Tanıma dizilerinin sayıları,

—Marker genlerinin tipi ve sayıları

—

    gibi özellikleri açısından birçok farklı klonlama vektörü vardır.

Başlıca Vektörler;

—Plasmidler

—Bakteriyofajlar

—Cosmidler

—Bakteri Yapay Kromozomları (BAC)

—Maya Yapay Kromozomları (YAC)

—Memeli Yapay Kromozomları (MAC)

—İnsan Yapay Kromozomları (HAC)

—İfade Vektörleri

  Virüsler canlı hücrelere girebilirler ve çoğalabilirler. Bir kromozomal gen, viral genom içerisine sokulursa, gen virüs DNA’sı ile birlikte replikasyona uğrar ve çoğalır. Lambda fajının genlerinin hepsi tanımlanmış, tüm genomunun haritası çıkarılmış ve nükleotit dizisi belirlenmiştir. ʎ fajının genetik olarak değiştirilmiş suşları vektör olarak kullanılır.