Temelde 3 aşamadan meydana gelir;
Hücre
duvarının parçalanması.
DNA-Protein
kompleksinin çözülmesi.
DNA’nın
ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması.
Değişik organizmalardaki yapısal farklılıklar
çeşitli izolasyon yöntemlerinin kullanılmasını gerektirebilir.
Genin Elde Edilmesi
A.
İstenilen genin yer aldığı kromozom uygun Restriksiyon Endonükleaz
Enzimleri ile parçalanır.
Bu
enzimler DNA’yı 6-8 taban çiftinden oluşan ve “palindrom” adı verilen özgül bölgelerden keser.
Palindrom; DNA ipliğinin 3’ ucundan itibaren okunduğunda aynı nükleotidlerin yer
aldığı DNA dizileridir.
Enzimler
DNA üzerinde 2 türlü kesi yapar. Biri yapışkan uçlar oluşturan, diğeri palindromların tam ortasından yapılan ve kör ya da küt(blunt) uçlar oluşturan kesilerdir.
B.
İstenilen genler orijinal kromozomdan mekanik yol ile edilebilir.
C.
Sentetik olarak elde edilebilir.
D.
İstenilen gene ait mRNA’dan reverse transkriptaz enzimi yardımı ile cDNA (komplementer DNA) elde edilebilir.
DNA Parçalarının Vektörler İle
Birleştirilmesi;
Vektörler,
kendilerine takılan DNA parçasını nakleden ve replike eden taşıyıcı DNA molekülleridir.
Bir DNA
molekülünün vektör olarak kullanılabilmesi için birtakım özelliklere sahip
olması gerekir;
a.Kendini
ve taşıdığı herhangi bir DNA parçasını bağımsız olarak replike edebilmelidir.
b.Klonlanacak
DNA parçasının insersiyonuna olanak tanıyan birçok tanıma dizisi içermelidir.
c.Vektörde
seçicilik sağlayan “marker genler” bulunmalıdır. Bunlar, vektör taşıyan ve
taşımayan konak hücreleri ayırmak için gereklidir.
d.Vektör
ve vektörün taşıdığı DNA parçası konaktan kolaylıkla ayrıştırılabilmelidir. Konak özgüllüğü,
Taşıdıkları
parçanın büyüklüğü,
Kopya
sayıları,
Tanıma
dizilerinin sayıları,
Marker
genlerinin tipi ve sayıları
gibi özellikleri açısından birçok farklı
klonlama vektörü vardır.
Başlıca Vektörler;
Plasmidler
Bakteriyofajlar
Cosmidler
Bakteri
Yapay Kromozomları (BAC)
Maya
Yapay Kromozomları (YAC)
Memeli
Yapay Kromozomları (MAC)
İnsan
Yapay Kromozomları (HAC)
İfade
Vektörleri
Virüsler canlı hücrelere girebilirler ve
çoğalabilirler. Bir kromozomal gen, viral genom içerisine sokulursa, gen virüs
DNA’sı ile birlikte replikasyona uğrar
ve çoğalır. Lambda fajının genlerinin hepsi tanımlanmış, tüm
genomunun haritası çıkarılmış ve nükleotit dizisi belirlenmiştir. ʎ fajının genetik olarak değiştirilmiş suşları vektör olarak kullanılır.